茶多酚诱导人胆囊癌细胞系GBC-SD 细胞凋亡的机制
连超夏俊高琴1
张静
2
（蚌埠医学院医学检验系生物化学与分子生物学教研室，安徽
蚌埠233030）
〔摘
要〕目的
探讨茶多酚体外诱导人胆囊癌细胞系GBC-
SD 细胞凋亡的机制。方法茶多酚作用GBC-SD 细胞48h 后，光学显微镜观察
细胞形态变化；Hoechst33258/PI 双染，激光扫描共聚焦显微镜观察茶多酚诱导人胆囊癌细胞系GBC-S
D 细胞凋亡作用；DCFH-DA 为细胞内活性氧探针，激光扫描共聚焦显微镜检测茶多酚对人胆囊癌细胞系GBC-SD 细胞活性氧（ROS ）水平的影响，分光光度法测定茶多酚对人胆囊癌细胞系GBC-SD 细胞内caspase-3活性的影响。结果50、100、200μg /ml 茶多酚作用GBC-SD 细胞48h 后，人胆囊癌细胞系GBC-SD 细胞呈现典型的凋亡特征；激光扫描共聚焦显微镜下观察茶多酚作用后GBC-SD 细胞ROS 明显上升，细胞内caspase-3活性增强（P ＜0.01）。结论茶多酚能显著诱导人胆囊
癌细胞系GBC-SD 细胞发生凋亡作用，其机制可能是ROS 过量积聚、激发caspase 级联反应，从而诱导细胞凋亡。
〔关键词〕茶多酚；GBC-SD 细胞；活性氧；caspase-3〔中图分类号〕R735.8
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2012）10-2077-04；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.10.038
A study on apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells induced by tea polyphenols
LIAN Chao-Qun ，XIA Jun ，GAO Qin ，et al .
Medical Inspection Department ，Bengbu Medical College ，Bengbu 233030，Anhui ，China
【Abstract 】Objective To observe the effect of tea polyphenols on apoptosis in cultured human gallbladder carcinoma cell line GBC-SD cells and its correlation with intracellular reactive oxygen species （ROS ）and caspase-3changes.Methods After GBC-SD cells cultured in vitro were treated with tea polyphenols for 48h.Cellular morphological changes were observed by means of phase contrast microscopy.The cell apoptosis was observed by laser scanning confocal microscope after stained with Hoechst33258/PI.The effect of the tea polyphenols on in-tracellular reactive oxygen species （ROS ）level of the GBC-SD cells was measured after stained DCFH-DA with by laser scanning confocal mi-croscope.The activity of caspase-3was determined by colorimetric assay.Results The characteristic morphological changes of apoptosis were
observed by phase contrast microscopy and laser scanning confocal microscope in GBC-SD exposed to 50，100，200μg /ml tea polyphenols for
48h.When GBC-SD cells were treated with tea polyphenols for 48h ，ROS level was markedly increased （P ＜0.01）and the activity of
caspase-3（P ＜0.01）was increased in GBC-SD cells by tea polyphenols.Conclusions Tea polyphenols induces the apoptosis of GBC-SD
cells significantly ，which may be related to the mechanism of increasing intracellular ROS level and activating caspase-3.
【Key words 】Tea polyphenols ；GBC-SD cells ；Reactive oxygen species ；Caspase-3基金项目：国家自然科学基金项目（81000074）；安徽省教育厅自然科学
研究项目（KJ2012B108，
KJ2011Z255）1
蚌埠医学院生理教研室2
蚌埠医学院遗传教研室
通讯作者：张
静（1979-），女，副教授，主要从事中草药有效成分及药
理作用研究。
第一作者：连超（1976-），男，讲师，硕士，主要从事肿瘤分子生物学
研究。
胆囊癌是胆道系统常见的恶性肿瘤，在我国约占肝外胆道肿瘤的25%，发病隐匿，又缺少特异性的早期诊断指标，多数患者在就诊时病情已发展到晚期阶段，手术切除率较低，术后复发率高，术后5年生存率不到5%，且化疗、放疗疗效均不理想，预后极差
〔1，2〕
。常规化疗药物对胆囊癌的效果较差，急需寻
胆囊癌高效低毒的药物。茶多酚（tea polyphenols ，TP ）是茶叶中的主要成分，约占茶叶干重的30%，对肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞具有诱导凋亡的作用
〔3 6〕
，而TP 对胆
囊癌的研究较少。笔者在前期研究中发现TP 有抑制人胆囊癌细胞系GBC-SD 细胞增殖的作用，因此，本实验观察了TP 对GBC-SD 细胞的凋亡诱导效应，并对活性氧（ROS ）水平的改变
以及caspase-3在细胞凋亡中的作用进行初步探讨。1材料与方法1.1
材料与试剂
人胆囊癌细胞GBC-
SD 购自中科院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所。TP 纯度98%，购自南京泽朗医药科技有限公司。称取TP 40mg ，溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS ）配制成40mg /ml 的母液，
0.22μm 微孔滤膜过滤，分装后－20ħ冰箱保存备用。小牛血清购自杭州四季青工程材料有限公司；RPMI1640购自Gibco 公司；DMSO 、MTT 、Ho-echst33258购自Sigma 公司；ROS 探针2，7-二氯荧光乙酰乙酸盐（DCFH-DA ）、PI 、caspase-3活性检测试剂盒购自北京碧云天生物科技有限公司，余为国产分析纯试剂。1.2
GBC-SD 细胞培养
人胆囊癌细胞株GBC-
SD 用含10%小牛血清RPMI1640培养，在5%CO 2、37ħ培养，细胞呈贴壁生长，0.25%胰酶消化，对数生长期细胞用于实验。1.3
茶多酚对GBC-SD 细胞作用的形态学观察取对数生长
期的GBC-SD 细胞，按每孔3000个细胞接种于96孔板。37ħ、5%CO 2培养箱中培养24h ，分组进行药物处理，分阴性对照组和TP 实验组，阴性对照组只加培养液和细胞，
TP 实验
组分别加入0、
50、100、200μg /ml 的TP 。继续培养48h 后在倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态变化。1.4
TP 对GBC-SD 细胞凋亡的观察
将对数生长期的GBC-SD 细胞以3ˑ105个/ml 接种于35mm Petri 培养皿底中间的圆形凹槽里，
待24h 贴壁后，分组进行药物处理，分阴性对照组和TP 实验组，阴性对照组只加培养液和细胞，实验组分别加入0、50、100、200μg /ml 的TP 。作用48h 后，PBS 洗1次，加5μg /ml 的Hoechst 33258染液于37ħ避光染40min ，吸去染液，加入5μg /ml 的PI 染液，4ħ避光染10min ，PBS 漂洗1次。立即用激光共聚焦扫描显微镜检测分析细胞凋亡情况。1.5
TP 对GBC-SD 细胞内ROS 影响的检测
细胞处理方式
以及给药方法同1.4，药物作用48h 后吸出Petri 皿中的培养液，用PBS 洗涤2 3次后，加入DCFH-DA 液，使终浓度为10μmol /L ，在37ħ、体积分数为5%CO 2培养箱内避光培育20min ，吸除染液，用PBS 洗涤3次，利用激光共聚焦扫描显微镜检测其荧光强度。1.6
TP 对GBC-SD 细胞内caspase-3活力的影响
将对数生
长期的GBC-SD 细胞以3ˑ105个/ml 接种于6孔培养板培养24h 后，分组进行药物处理，药物处理同1.4，药物作用48h 后收集细胞，按照100μl /200万个细胞的比例加入裂解液，冰浴裂解15min 。4ħ，12000r /min 离心15min ，把上清转移到冰浴预冷的离心管中，
置于冰上。按试剂盒说明进行操作。  1.7统计学处理采用统计软件SPSS11.0处理，数据以x ʃs
表示，多组间比较采用单因素方差分析。2结
果
2.1
TP 对GBC-SD 细胞形态的影响
在倒置相差显微镜下
观察给药组与阴性对照组细胞的生长形态，
发现对照组GBC-SD 细胞胞体大，生长旺盛密集，几近铺满板底或已长满，胞体折光性好，轮廓饱满清晰；经不同浓度茶多酚诱导作用48h 后，GBC-SD 细胞随药物浓度梯度呈现不同的抑制作用，细胞数量明显少于对照组，光泽度下降，细胞失去贴壁生长的特性，脱落细胞增多，形态由梭形逐渐变圆，胞质皱缩，胞体缩小，染质斑块状聚集。随着药物浓度的升高，此现象更加明显，具有一定的量效关系。见图1。2.2
TP 对GBC-SD 细胞凋亡的影响
经Hoechst 33258/PI 荧
光染之后，激光扫描共聚焦显微镜观察到对照组的GBC-SD 细胞膜完整，无红荧光，细胞核形态饱满，呈圆形或椭圆形，核内荧光较弱，呈均一的淡蓝。而茶多酚作用48h 后，50μg /mlTP 实验组的GBC-SD 细胞核呈亮蓝，部分细胞核呈分叶、碎片状或边集，呈现早期凋亡特征。100 200μg /ml TP 实验组的GBC-SD 细胞核固缩现象则更为明显，部分GBC-SD 细胞核呈紫红或深红，GBC-SD 细胞处于凋亡的中晚期。见图2
。
图1茶多酚作用48h 后GBC-
SD 细胞形态改变情况（ˑ400
）图2Hoechst 33258/PI 荧光染观察GBC-SD 细胞凋亡（ˑ400）
·8702·中国老年学杂志2012年5月第32卷
图3不同浓度茶多酚对GBC-SD细胞ROS影响的激光扫描共聚焦显微镜观察（ˑ400）
2.3不同浓度TP对GBC-SD细胞ROS的影响不同浓度TP
处理GBC-SD细胞48h后，采用激光共聚焦显微镜观察细胞内
ROS的变化。GBC-SD细胞内ROS随着TP浓度的增加而升高，
除50μg/ml TP组外，100 200μg/ml TP实验组的GBC-SD细胞
reactive oxygen species (ros)
内ROS浓度的增加具有显著性差异（P＜0.01），并且ROS随TP
剂量的增加而升高，呈一定的剂量依赖关系。见图3、表1。
2.4TP对GBC-SD细胞caspase-3活性的影响不同浓度TP
作用48h后的GBC-SD细胞内caspase-3活性均较阴性对照组
增强，与阴性对照组相比，TP各浓度实验组caspase-3活性的提
高均有显著性差异（P＜0.01）。见表1。
表1不同浓度茶多酚对GBC-SD细胞ROS及
caspase-3活性的影响（xʃs，n=3）
组别
剂量
（μg/ml）
ROS浓度（FI，n=3）OD405
阴性对照组－77.44ʃ17.180.112ʃ0.012
茶多酚实验组5089.16ʃ14.270.187ʃ0.0141）
100288.07ʃ24.021）0.334ʃ0.0261）
200350.50ʃ15.071）0.316ʃ0.0161）
与阴性对照组比较：1）P＜0.01
3讨论
TP是一种多酚类化合物，具有抗氧化及清除自由基等多种生理活性和药理作用，尤其在防癌和抗癌方面具有重要的意义。本实验提示TP可能具有诱导GBC-SD细胞凋亡的作用。通过Hoechst33258/PI双染法直接观察细胞核形态变化，是判断凋亡细胞的基本参数。本研究发现TP作用48h后，经Ho-echst33258/PI染后，50μg/ml TP实验组GBC-SD细胞核呈亮蓝，100 200μg/ml TP实验组GBC-SD部分细胞的细胞核固缩现象更明显，部分GBC-SD细胞的细胞核呈紫红或深红，GBC-SD细胞呈现典型的凋亡形态，说明TP可以诱导GBC-SD 细胞凋亡。
近年研究表明氧化应激参与了细胞凋亡的过程，并起关键作用。ROS是细胞有氧呼吸过程中产生的O2代谢产物及其衍生的含氧物质的统称，包括所有的含氧自由基和过氧化物。ROS在凋亡中的作用日益受到重视。Chung等〔7〕用绿茶多酚对前列腺癌细胞DU145进行处理后发现，茶叶中一种重要的多酚类物质表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）对DU145有较为明显的抑制作用，经EGCG处理后的细胞中过氧化物水平也有显著提高，证明其可能通过诱导ROS 形成引发细胞凋亡。Nakazato等〔8〕用EGCG诱导HS-sultan和RPM I8226以及新鲜骨髓瘤细胞凋亡时发现，细胞内ROS升
高，抗氧化剂、过氧化氢酶、Mn2+、超氧化物歧化酶均可明显降低ROS的产生量，并减弱EGCG诱导的凋亡，表明ROS在EGCG诱导B细胞凋亡的过程中起着关键性的作用。本研究发现GBC-SD细胞内ROS随着TP浓度的增加而升高，尤其是100 200μg/ml TP组作用GBC-SD细胞48h后，能使细胞内ROS浓度极显著增加，表明ROS在TP诱导GBC-SD细胞凋亡的过程中起着一定的作用。
Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，它的激活也是启动细胞凋亡的重要途径，caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中的主要效应因子〔9〕。Spinella等〔6〕研究认为，EGCG抑制卵巢癌细胞生长和诱导凋亡与降低Bcl-X（L）的表达与活化caspase-3相关。本实验研究发现经不同浓度TP作用48h后的GBC-SD细胞内caspase-3活性均较阴性对照组增强，与阴性对照组相比，100 200μg/ml TP作用GBC-SD细胞48h后，均极显著提高caspase-3的活性。最近几年有研究表明，caspase家族中caspase-3的激活受ROS的调控〔10〕，笔者在前期研究中也发现姜黄素可能通过ROS水平升高激活caspase-3，从而诱导人肺癌细胞株A549细胞凋亡〔11〕。提示TP可以导致GBC-SD细胞内ROS积聚，过量ROS造成细胞广泛性氧化损伤，从而参与caspase的激活，诱发凋亡。
综上所述，TP能显著诱导人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的机制可能是TP可以促使GBC-SD细胞中ROS积聚，过量ROS造成线粒体膜损伤，导致线粒体通透性转换孔开放释放各种促凋亡因子，激发Caspase级联反应，从而诱导细胞凋亡。
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连超等茶多酚诱导人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞凋亡的机制第10期
Surg ，2007；11：671-81.3贾旭东，韩驰，陈君石，等.茶多酚和茶素对人肝癌细胞株
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〔2011-07-15收稿2011-10-20修回〕
（编辑徐杰）
米非司酮对卵巢癌OVCAR3细胞及模型鼠HLA-G 表达的影响
王建英
何晶程建新李勇
1
（河北医科大学第四医院妇产科，河北石家庄050011）
〔摘
要〕目的探讨米非司酮、顺铂卵巢癌的作用机制。方法培养卵巢癌OVCAR3细胞株，并建立荷卵巢癌裸鼠模型，采用RT-PCR 技术检测米非司酮、顺铂对卵巢癌OVCAR3细胞和裸鼠皮下移植瘤组织中HLA-
G mRNA 表达水平的影响。结果米非司酮能明显下调OVCAR3细
胞HLA-G mRNA 表达水平差异显著（P ＜0.01）。顺铂对细胞中HLA-G mRNA 表达无明显影响，组间方差分析无显著差异（F =1.138，P ＞0.05）。不同分组裸鼠移植瘤组织之间HLA-G mRNA 水平比较差异显著（F =16.275，P ＜0.01）。米非司酮组、顺铂组和联合组两两比较，联合组HLA-G mRNA 表达显著低于顺铂组（P ＜0.01），联合组HLA-G mRNA 表达有低于米非司酮组的趋势，但差别无统计学差异。结论
米非司酮抗肿瘤机制与下调
HLA-G 抗原表达有关，而顺铂此方面作用不明显，二者联合使用可以起到互补作用，为临床顺铂耐药性卵巢癌的提供了新的思路。
〔关键词〕卵巢癌；人类白细胞抗原-G ；米非司酮；顺铂〔中图分类号〕R737
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2012）10-2080-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.10.039
基金项目：河北省科学技术研究与发展计划项目（No.08276101D-78）1
河北医科大学第四医院外科
通讯作者：李
勇（1958-），男，博士，主任医师，博士生导师，主要从事肿瘤外科的研究。
第一作者：王建英（1973-），女，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事
妇科肿瘤的研究。
研究卵巢恶性肿瘤的发生发展机制，寻求最根本有效的方案，提高卵巢癌患者生存质量一直是妇科肿瘤学者面临的重大挑战。人类白细胞抗原-G （HLA-G ）是近年来发现的非经典HLA-I 类分子，最早在胎盘绒毛膜外滋养层细胞表面发现有大量表达，其在胎儿免疫耐受方面的作用机制已得到国内外学者
的公认，并且研究也发现HLA-G 抗原表达与肿瘤的免疫逃逸有关
〔1 4〕
。国外曾有研究报道了孕激素、绒毛膜促性腺激素
可通过上调HLA-G 的水平以达到保胎的目的〔5〕
，由此推测临
床的引产药物如米非司酮等引起流产的机制可能与其能下调HLA-G 的水平有关，进而推测这些药物在免疫逃逸方面的抗肿瘤机制，为恶性肿瘤临床免疫、生物开辟新的途径。1材料与方法1.1
材料
1.1.1培养细胞卵巢癌细胞株（OVCAR3），河北省肿瘤研
究所科研中心提供。
1.1.2
裸鼠
BALB /c 裸鼠，4 6周龄，雌性，16 20g ，购自
中国医学科学院动物研究所，在河北医科大学动物试验中心SPF 环境下饲养。1.1.3
试剂
HLA-G 单克隆抗体购于英国Abcam 公司；引物
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；米非司酮纯品（RU486）购于北京紫竹药业有限公司，顺铂购于山东齐鲁制药厂；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR ）试剂盒购于Fermentas 公司；Trizol 试剂盒购于美国Invitrogen 公司。1.2方法
1.2.1
OVCAR3细胞培养
用含10%胎牛血清、
100U /ml 青霉素、100g /ml 链霉素的培养基，在37ħ、5%CO 2的恒温培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化，2 3d 传代一次。1.2.2
RT-PCR 技术
参照本课题组前部分实验，确定试验组
米非司酮浓度为20μg /ml 、40μg /ml ，顺铂浓度为6.25μg /ml 、12.5μg /ml 。药物作用于OVCAR3细胞72h ，用Trizol 试剂盒提取细胞总RNA ，用紫外分光光度法定量RNA 。将等量的RNA 反转录为cDNA 第1链，以获得的逆转录产物为模板进行PCR ，扩增HLA-G 和β-肌动蛋白（β-actin ）基因，使用凝胶分析
·
0802·中国老年学杂志2012年5月第32卷

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