中国组织化学与细胞化学杂志
CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY
第27卷第1期2018年2月
V ol .27.No .1February .2018
〔收稿日期〕2017-10-09  〔修回日期〕2018-02-02〔基金项目〕国家自然科学基金(81071269，81402296)〔作者简介〕吴尚蓉，女(1993年)，汉族，硕士研究生
*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：chengjunhu@whu.edu
自噬促进骨髓间充质干细胞复制性衰老过程中衰老
相关基因表达
吴尚蓉1，郑勇1，卓儒红2，何柳1，胡成俊1*
（1武汉大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系；2武汉大学中南医院综合医疗科，武汉，430071）
〔摘要〕目的 探究和分析自噬在骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs ）复制性衰老过程中的作用和可能的调控机制。方法  采用全骨髓细胞贴壁法获得大鼠BMSCs ，体外连续传代培养至第6代（passage 6, P6），分别用自噬抑制剂巴佛洛霉素A1（b afilomycin A1, BaF1）和自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin, Rap ）处理P6 BMSCs 。qPCR 和Western blot 分析细胞自噬活性和衰老相关基因表达的改变，DCFH-DA 染法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS ）的含量。结果  与增殖活跃的P2 BMSCs 相比，P6 BMSCs 增殖停滞，Brdu 掺入率极低，SA-β-gal 染阳性率高达90%，且P6 BMSCs 的p21Waf1和p16ink4a  mRNA 表达水平明显升高。在P6 BMSCs ，ATG12 mRNA 表达水平和LC3II/LC3I 的比值升高，细胞内ROS 含量也增加。对P6 BMSCs 采用BaF1处理阻断自噬流后，p21Waf1和p16ink4a  mRNA 表达水平降低，ROS 含量增加；用Rap 处理后，ATG12 mRNA 表达水平和LC3II/LC3I 蛋白比值均明显升高，且p21Waf1和p16ink4a  mRNA 表达水平升高，ROS 含量降低。结论  通过体外连续培养，P6 BMSCs 进入衰老状态；自噬可能通过促进衰老相关基因表达调节BMSCs 的复制性衰老。
〔关键词〕骨髓间充质干细胞；复制性衰老；自噬；活性氧
〔中图分类号〕R329            〔文献标识码〕A            DOI ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2018. 01. 001
Autophagy promotes aging-related gene expression during bone marrow mesenchymal
stem cell aging
Wu Shangrong 1, Zheng Yong 1, Zhuo Ruhong 2, He Liu 1, Hu Chengjun 1*
(1Department of Anatomy and Embryology, Wuhan University School of Basic Medical Sciences; 2Department of Integrated Medicine,
Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China)
〔Abstract 〕Objective To explore the roles and possible mechanisms of autophagy in regulating the aging of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Methods After being isolated from the femora and tibiae of Sprague Dawley rats, BMSCs were cultured in vitro  for 6 passages. They were then treated with autophagy inhibitor baflomycin A (BaF1) or activator Rapamycin (Rap). Cell proliferation and aging sign were measured by Brdu incorporation and β-galactosidase (SA-β-Gal) staining. qPCR and Western blot were performed to determine the expression of aging and autophagy-
associated genes and proteins. The levels of reactive oxygen species (ROS) were measured by DCFH-DA staining. Results Compared to passage 2, BMSC proliferation indicated by Brdu incor-poration rate significantly reduced at passage 6 accompanied by increased SA-β-Gal staining and ROS accumulation. At this passage, there was also a significant increase in ATG12, p21Waf1, and p16ink4a  mRNA levels as well as LC3II/LC3I ratio compared to BMSCs at passage 2. In response to BaF1 treatment, it was showed blocking autophagy flux accompanied by decreased p21Waf1 and p16ink4a mRNA levels but higher intracellular ROS. In contrast, Rap treatment further increased ATG12, p21Waf1 and p16ink4a  mRNA levels and LC3II/L-C3I ratio but reduced ROS. Conclusion  Autophagy may regulate replicative aging of BMSCs through increasing aging related gene expression.
〔Keywords 〕
Bone marrow mesenchymal stem cells; aging; autophagy; reactive oxygen species
骨髓间充质干细（Bone marrow mesenchymal
stem cells, BMSCs ）具有自我更新和分化成多种细胞谱系的特性[1-3]，并且具有来源广泛、易于分离培养和免疫调节作用等特点[4]，这些特性使其成为组织工程和再生医学中的种子细胞。然而，BMSCs
像其
中国组织化学与细胞化学杂志
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它正常体细胞一样体外寿命有限，在经过一定数量的细胞分裂后，BMSCs进入生长停滞的复制性衰老状态[5]。随着BMSCs进入衰老的状态，BMSCs逐渐丧失多向分化的能力，这既不利于组织的更新和修复，也是阻碍BMSCs临床应用的重要瓶颈[6, 7]。因此，需要进一步阐明BMSCs的衰老机制，探讨延缓BMSCs衰老的可能的方法，这对基于BMSCs的和组织工程的应用具有重要的价值。
细胞衰老是一个包括氧化应激、端粒异常、染体损伤和细胞自噬等多种细胞分子事件共同参与的复杂生物现象[7, 8]，根据衰老的发生是否与端粒缩短有关，可以分为复制性衰老和应激性衰老两种类型。衰老的细胞虽然出现细胞周期的停滞，但是细胞的新陈代谢还在继续[8]。以往对应激性衰老的研究发现，衰老细胞中自噬活性的增强起到稳定衰老状态的作用[9]。然而，自噬对复制性衰老的影响和具体调控机制仍然不甚明确。
自噬能够清除异常的蛋白质和受损的细胞器，从而维持细胞的能量代谢以利于细胞的存活[10]。异常的蛋白质和损伤的线粒体主要由活性氧（reactive oxygen species, ROS）的积累引起[11, 12]。ROS是氧
化应激反应中的重要诱导因子，过度积累的ROS会破坏细胞稳态，引起多种氧化应激损伤和线粒体的功能障碍[13]。有报道指出，衰老BMSCs中ROS含量增加[14]。自噬可以通过清除ROS损伤的线粒体和蛋白质，减轻ROS导致的氧化应激损伤[15]。本研究旨在探讨自噬对BMSCs复制性衰老的调控作用，分析自噬对ROS的调控与BMSCs复制性衰老的关系。
材料和方法
1  材料
雄性Sprague-Dawley大鼠，110～150g，购自武汉大学动物中心。5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）、雷帕霉素（rapamycin, Rap）购自Selleck公司；巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1, BaF1)购自Cayman Chemical公司；细胞衰老β-半乳糖苷酶染试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；逆转录试剂盒购自TaKaRa公司；RT-PCR试剂盒购自Bimake公司；LC3I/II一抗购自CST公司；Brdu一抗、Cy3标记的羊抗小鼠IgG二抗均购自武汉博士德生物公司；活性氧检测试剂盒、RIPA裂解液、苯（PMSF）、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗购自北京博奥龙免疫技术有限公司；引物均由武汉擎科生物技术有限公司合成。
2  骨髓间充质干细胞的分离、培养以及体外衰老模型的建立
参照本实验室已有的方法[16]，全骨髓贴壁法获得大鼠骨髓间充质干细胞，标记为P0，置于37℃，5%的CO2的培养箱中培养，3d后首次换液，后期每2~3d换一次液以去除未贴壁的杂细胞，细胞70%~80%融合后用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。待细胞传到第6代时，分别以400nmol/L BaF1和400nmol/L Rap处理24h，进行后续实验。
3  细胞衰老β-半乳糖苷酶染检测细胞衰老情况
六孔板中细胞长到70%~80%融合时，按照衰老β-半乳糖苷酶染试剂盒说明书进行染，在37℃孵育过夜，光学显微镜下随机选取3个视野计数半乳糖苷酶阳性细胞的比率。
4  5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）掺入法检测细胞增殖能力
将细胞接种到24孔板，待细胞达到70%融合时，加入Brdu（终浓度10mmol/L）孵育24h后，弃掉培养基，PBS洗3次，加入固定液（甲醇：乙酸=3：1）后于-20℃固定20min，PBS洗3次，1mol/L HCl冰上变性30min，2mol/L HCl 37℃变性30min。Brdu一抗（1:150）室温孵育2h，PBST洗3次，Cy3标记的羊抗小鼠IgG二抗（1:800）孵育1h，PBST洗3次后DAPI（1:1000）染核5min，在荧光显微镜下观察阳性细胞的比率。
5  Western blot检测自噬相关蛋白表达情况
待细胞长到80%融合时，将细胞用胰酶消化下来后，用含有PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解30mim。样品的蛋白浓度用BCA试剂盒测定。样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上后，5%脱脂牛奶封闭1h，分别加入一抗LC3I/II （1:1000），GAPDH（1:5000），4℃孵育过夜，TBST洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000），室温孵育1h，TBST洗3次后用ECL 化学发光试剂盒显影蛋白条带。
6  实时荧光定量qPCR检测衰老和自噬相关基因的表达情况
用Trizol法提取细胞总RNA，按照说明书的操作方法用TaKaRa逆转录试剂盒将RNA逆转录成
吴尚蓉等.自噬促进骨髓间充质干细胞复制性衰老过程中衰老相关基因表达
第1期 3
待细胞70%~80%融合时，用胰酶将细胞消化下来，PBS洗一遍后离心，加入1ml稀释的DCFH-DA 染液，37℃培养箱中孵育20min，使探针与细胞充分接触。PBS洗3次后，用PBS重悬，上流式细胞仪检测DCFH-DA荧光，其荧光强度反映胞内活性氧（ROS）的水平。
8  统计学分析reactive oxygen species (ros)
采用Prism5软件进行实验数据分析，所有数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05时表示具有显著性差异。
结果
1  第6代BMSCs进入复制性衰老状态
通过分析BrdU掺入率，SA-β-gal染阳性率和衰老相关基因（p21Waf1和p16ink4a）的表达确定BMSCs 的衰老状态。与第二代（passage 2, P2）的BMSCs 比较，P6细胞大多扁平宽厚，形态不规则；细胞增殖停滞，Brdu掺入率由P2细胞的80%降低到10%（图1A）。通过SA-β-gal染，发现在P6 BMSCs 有90%的细胞的核周呈现蓝（SA-β-gal染阳性）染（图1B）。在P6 BMSCs，衰老相关基因p21Waf1和p16ink4a mRNA表达水平较在P2 BMSCs明显升高（图1C）。这些结果说明BMSCs在培养至P6时即进入了复制性衰老的状态。
2  衰老BMSCs自噬活性增强
为了观察体外连续传代培养BMSCs自噬活性的变化，利用qPCR和Western blot检测自噬基因的表达情况。与P2 BMSCs比较，P6 BMSCs自噬相关基因ATG12 mRNA的表达水平明显升高（图2A），自噬特征性蛋白LC3II/LC3I比值也明显升高(图2B)。这些结果说明体外连续培养BMSCs发生复制性衰老时伴随着自噬活性增强。
3  衰老BMSCs氧化应激增强
应用DCFH-DA染法检测细胞内ROS的含量，观察细胞内氧化应激水平的改变。DCFH-DA染结果显示，与P2 BMSCs比较，P6 BMSCs的荧光强度较P2细胞明显增强（图3）。由此提示，体外连续培养BMSCs发生复制性衰老时，伴随着氧化应激水平增强。
4  衰老BMSCs自噬活性的增强可促进衰老相关基因表达
为了分析复制性衰老的BMSCs自噬活性的改变与衰老基因表达的关系，我们使用自噬抑制剂巴佛洛霉素A1（BaF1)和自噬激活剂雷帕霉素（Rap）处理P6 BMSCs。结果显示，与未作处理的P6组相比，BaF1处理组的自噬流被阻断（图4A），自噬相关基因ATG12 mRNA和衰老相关基因p21Waf1、p16ink4a mRNA表达水平降低（图4B）；而Rap处理组ATG12 mRNA表达水平和LC3II/LC3I蛋白比值均明显升高（图4C, D），且衰老相关基因p21Waf1和p16ink4a mRNA表达水平升高（图4E）。由此提示，自噬活性的增强可促进BMSCs复制性衰老的进程。
5  衰老BMSCs自噬活性增强能降低细胞ROS含量
为了观察复制性衰老BMSCs（P6 BMSCs）自噬活性的改变对细胞内氧化应激水平的影响，P6 BMSCs在分别经过BaF1和Rap处理后，通过DCFH-DA染检测发现，与未作处理的P6 BMSCs相比，BaF1处
理组荧光强度增强，ROS含量增加，而Rap 处理组荧光强度减弱（图5），ROS含量减低。由此提示，在复制性衰老BMSCs中自噬参与细胞中ROS含量的调节。
讨论
cDNA。各引物序列见表1。qPCR反应条件：预变性：95℃ 5min，变性：95℃ 5s，退火：56℃ 30s，延伸：72℃ 20s，40个循环。采用2－ΔΔCt法对试验结果进行数据处理，每组实验至少重复3次。
7  DCFH-DA染法检测细胞内活性氧（ROS）
表1 定量引物序列
Tab. 1  Primer sequence
基因正向序列（5’→ 3’）反向序列（5’→ 3’）
p21Wa f GGCAAGAGTGCCTTGACGAT AAGAAAGCCCTCCCCAGTTC p16ink4a ATCTACTCTCCTCCGCTGGG TATGCTCGGTTGCCAGAAG ATG12AAACGTGAGCCAAGGGGATT GGAAACTTGGTGCTGCTTGG GAPDH GATGGGTGTGAACCACGAGAAA ACGGATACATTGGGGGTAGGA
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图1  体外连续培养对BMSCs 增殖能力及衰老的影响。 A ，BrdU 掺入法检测P2和P6 BMSCs 的增殖能力； B ，SA-β-gal 染法检测P2和P6 BMSCs 的衰老情况；C ，qPCR 检测p21Waf1和p16ink4a  mRNA 的表达水平； *，与P2 BMSCs 比较，0.01<P<0.05；比例尺：A ，100µm ；B ，250µm
Fig. 1 The proliferation and aging of BMSCs during continuous in vitro  culture. A, Brdu incorporation assay was performed to compare the proliferative ability of BMSCs at P2 and P6; scale bar, 100µm; B, SA-β-gal staining comparison between passage 2 and 6; scale bar, 250µm; C, qPCR analysis of p21Waf1 and p16ink4a  mRNA levels; *, 0.01<P<
0.05, compared with P2 BMSCs
图2  体外连续培养BMSCs 时自噬相关蛋白和基因的变化。A ，qPCR 检测ATG12 mRNA 的表达水平；B ， LC3I/II 水平Western blot 检测（B1）及统计学分析（B2）；*，与P2 BMSCs 比较，0.01<P<0.05
Fig. 2 The changes of aging related gene and protein expressions in BMSCs during continuous in vitro culture. A, qPCR analysis of Atg12 mRNA levels; B, Western blot detection of LC3I/II and statistical analysis (B2); *, 0.01<P  <0.05, compared with P2 BMSCs
骨髓间充质干细胞在细胞和组织工程中有很大的应用潜力[17, 18]。但由于BMSCs 会经历复制性衰老，这对BMSCs 的广泛使用是极其不利的。在本研究中，我们通过在体外连续传代培养BMSCs
来获取复制性衰老的BMSCs ，在培养BMSCs 至P6时，BMSCs 增殖停滞，且呈现出宽大而扁平的细胞形态，SA-β-gal 染显示P6染阳性率达到90%，并且在P6细胞中p21Waf1和p16ink4a  mRNA 的表达水
吴尚蓉等.自噬促进骨髓间充质干细胞复制性衰老过程中衰老相关基因表达第1期
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图3体外连续培养BMSCs 时 ROS 含量的变化。A ，流式细胞术分析DCF 荧光强度；B ， DCF 荧光强度统计学分析；*，与P2 BMSCs 比较，0.01<P<0.05
Fig. 3 The changes of intracellular ROS during continuous culture of BMSCs in vitro ; A, flow cytometry analysis of DCF fluorescence intensity; B, statistical analysis of DCF fluorescence intensity; *, 0.01< P  <0.05,
compared with P2 BMSCs
图4 自噬活性对P6 BMSCs 衰老相关基因表达影响的检测。 A ，Western blot 检测BaF1组LC3I/II 表达；B ，qPCR 检测 BaF1组p21Waf1和p16ink4a  mRNA 表达水平的变化；C ，qPCR 检测Rap 组ATG12 mRNA 的表达；D ，Western blot 检测Rap 组LC3I/II 表达； E ，qPCR 检测Rap 组p21Waf1和p16ink4a  mRNA 的表达情况；*，与P2 BMSCs 比较，0.01<P<0.05
Fig. 4  The effect of autophagy on aging-related gene expression in P6 BMSCs. A, Western blot analysis of LC3 in BMSCs treated with BaF1; B, qPCR analysis of p21Waf1 and p16ink4a mRNA level changes in response to BaF1 treatment; and C, ATG12 mRNA level changes after Rap treatment; D, Western blot analysis of LC3 in BMSCs treated with Rap; E, qPCR analysis of p21Waf1 and p16ink4a mRNA levels in BMSCs treated with Rap; *, 0.01< P  <0.05, compared with P2 BMSCs
平也较P2 BMSCs 明显升高。按照以往衰老研究标准，在本研究中的P6 BMSCs 已经进入复制性衰老的状态。
细胞在进入衰老状态后，虽然发生细胞周期的阻滞，但细胞代谢并没有停止。其中自噬参与的代谢在细胞由增殖状态转变为衰老状态时起重要作用[19,

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