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合物，具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化[6-8]等多种作用，但其在神经炎症中的保护机制尚不明确。本研究主要观察了Gen对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小胶质细胞炎症反应的抑制作用。
1材料和方法
1.1  主要试剂
Gen和LPS购自美国Sigma Aldrich公司，NLRP3抗体购自美国Abcam公司，β-肌动蛋白（β-actin）抗体及二抗购自美国Santa Cruz公司，活性氧簇（ROS）的细胞渗透性指示剂CM-H2DCFDA、线粒体ROS指示剂MitoSOX TM红试剂、线粒体膜电位荧光探针JC-1和Alexa Fluor 488标记的二抗购自美国Molecular Probes公司，CD11b抗体、胱天蛋白酶1（caspase-1）比法测定试剂盒购自美国BioVision公司，IL-1β ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司。
1.2  原代小胶质细胞培养与分组
C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXX（沪）2017-0005；动物饲养于上海交通大学附属第六人民医院动物实验室，使用许可证号为SYXK（沪）2016-0020。参照文献[1]分离出生1 d C57BL/6J小鼠的原代小胶质细胞：先分离出大脑，去除脑膜和血管，获得皮层，加
入0.25%胰酶/EDTA消化，胎牛血清终止消化，收集细胞于培养瓶中培养，14 d后通过胰酶消化、摇动培养瓶选择性地收获原代小胶质细胞。通过CD11b染确定小胶质细胞培养的纯度>95%时进行下一步的试验。本研究已通过上海交通大学附属第六人民医院动物福利伦理委员会审查，伦理批号为2018-0049。实验分组：对照组、LPS组、Gen+LPS组。LPS组给予LPS（1 μg/mL）孵育原代小胶质细胞24 h；Gen+LPS组给予Gen（10 μmol/L）预孵育原代小胶质细胞0.5 h后，再加入LPS（1 μg/mL）处理24 h；对照组不做处理。
1.3  Caspase-1和IL-1β的测定
采用比法测定caspase-1活性，采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中的IL-1β浓度，实验步骤按照说明书要求进行。
1.4  细胞内ROS的检测
采用CM-H2DCFDA检测细胞内ROS的水平。细胞培养液中加入CM-H2DCFDA（终浓度为10 μmol/L），37 ℃孵育10 min后通过荧光酶标仪检测细胞内ROS水平的变化。
1.5  线粒体内ROS的检测
采用MitoSOX TM红试剂检测线粒体内ROS的水平。细胞培养液中加入MitoSOX TM红试剂（终浓
度为5 μmol/L），37 ℃孵育10 min后通过荧光酶标仪检测线粒体内ROS水平的变化。
1.6  线粒体膜电位的检测
采用JC-1染料观察线粒体膜电位的变化。细胞培养液中加入JC-1（终浓度为10 µg/mL），37 ℃孵育15 min，放置于荧光显微镜下观察。当线粒体膜电位下降时，红荧光减弱而绿荧光增强，通过红绿荧光强度的比值可衡量线粒体膜电位去极化的比例。
1.7  Western blotting
细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，加入CD11b一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，化学发光法显影，Quantity One软件分析条带灰度值。
1.8  免疫荧光染
细胞先用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗2次，然后用0.2% Triton X-100通透处理15 min，5%山羊血清室温封闭1 h，随后加NLRP3一抗4 ℃孵育过夜，用Alexa Fluor 488标记的二抗室温孵育1 h，PBS漂洗后封片，在免疫荧光显微镜下观察并拍照。
1.9  统计学分析
采用GraphPad 6.0软件进行统计学分析，定量资料以x—±s表示，单因素方差分析进行多组间比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1  Gen抑制LPS诱导的小胶质细胞CD11b高表达
与对照组比较，LPS组小胶质细胞CD11b表达显著升高（P=0.005）；Gen+LPS组小胶质细胞CD11b表达显著低于LPS组（P=0.007）（图1）。
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2.2    G en抑制LPS诱导的小胶质细胞NLRP3炎症小体活
化和炎症因子分泌
NLRP3免疫荧光结果显示，LPS组小胶质细胞NLRP3炎症小体激活。与对照组相比，LPS组小胶质细胞NLRP3免疫荧光明显增强；Gen+LPS组与LPS组相比，NLRP3免疫荧光明显减弱（图2A）。观察NLRP3
下游caspase-1和IL-1β的变化：与对照组相比，LPS刺激后小胶质细胞caspase-1活性和IL-1β分泌均显著升高（P=0.010，P=0.001）；Gen+LPS组与LPS组相比，caspase-1活性和IL-1β分泌明显下降（P=0.013，P=0.001）（图2B、C）。
注：①P=0.005，与对照组比较；②P=0.007，与LPS组比较。
图1  Western blotting分析Gen对LPS诱导小胶质细胞CD11b表达的影响
Fig 1  Effect of Gen on LPS-induced CD11b expression in microglia by Western blotting
注：A. 免疫荧光染观察小胶质细胞NLRP3炎症小体变化；B. 比法检测小胶质细胞caspase-1活性变化；C. ELISA法检测小胶质细胞IL-1β分泌变化。
①P=0.010，③P=0.001，与对照组比较；②P=0.013，④P=0.001，与LPS组比较。
图2  Gen对LPS诱导小胶质细胞的NLRP3炎症小体激活及IL-1β释放的影响
Fig 2  Effect of Gen on LPS-induced NLRP3 inflammasome activation and IL-1β release in microglia
2.3    G en减弱LPS诱导的小胶质细胞线粒体膜电位去极
化及线粒体ROS积聚
与对照组比较，LPS组小胶质细胞线粒体膜电位显著下降（P=0.014）；Gen+LPS组小胶质细胞线粒体膜电位明显高于LPS组（P=0.033）（图3A）。LPS组小胶质细胞线粒体和细胞内ROS明显高于对照组（P=0.011，P=0.004），Gen+LPS组小胶质细胞线粒体和细胞内ROS 显著低于LPS组（P=0.010，P=0.019）（图3B、C）。
A B C
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3  讨论
小胶质细胞是大脑的免疫细胞，约占大脑中神经胶质细胞的20%。研究[1, 9-10]表明，激活的小胶质细胞参与帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化等神经变性疾病的发病机制。在炎症刺激时，激活的小胶质细胞可产生肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-1β、IL-6、一氧化氮（nitric oxide ，NO ）、ROS 等多种神经毒性物质，介导中枢神经系统炎症反应，促进细胞死亡和神经变性。
NLRP3炎症小体是由NLRP3受体、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein ，ASC ）以及caspase-1前体蛋白构成的复合体。NLRP3炎症小体能调节caspase-1的活化，活化的caspase-1剪切IL-1β和
IL-18前体，促进其成熟和分泌到胞外，引起炎症反应[2]。NLRP3炎症小体异常活化参与阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化等多种疾病的发生[3, 11-12]。线粒体是细胞内ROS 的主要来源，有研究[1, 13]发现线粒体损伤后，线粒体ROS 水平升高，可以诱导NLRP3炎症小体活化，促进炎症因子IL-1β分泌增加。因此，抑制线粒体ROS 水平及NLRP3炎症小体活化可以发挥神经保护作用。
Gen 是一种天然异黄酮化合物，主要存在于豆科植物中，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、延缓衰老、预防早老性痴呆和雌激素样作用[6-8, 14-19]。Chong 等[6]报道Gen 抑制β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein ，Aβ）诱导的TNF-α分泌，发挥抗炎作用。有研究[8]表明Gen 能显著减少肝性脑病大鼠炎症因子IL-4、IL-1β和TNF-α的分泌，并提高模型大鼠认知功能。此外，有证据[18]显示Gen 明显改善
阿尔茨海默病模型动物的认知功能。Gen 还能抑制H 2O 2引起的N27多巴胺能神经元凋亡[19]。本研究拟探讨Gen 在LPS 诱导小胶质细胞炎症反应中的保护机制。Ji 等[20]发现当分别给予RAW 264.7巨噬细胞1、5或10 μmol/L Gen 预处理后再加入LPS 孵育24 h ，LPS 诱导的炎症因子TNF-α和IL-6释放明显减少，并且Gen 的抗炎作用呈浓度依赖性，10 μmol/L 浓度抗炎作用最强。因此，我们
采用10 μmol/L Gen 作为干预浓度观察其抗炎作用。本研究显示，LPS 刺激小胶质细胞后，CD11b 表达明显升高，与对照组比较差异有统计学意义，提示LPS 可激活小胶质细胞；而当给予Gen 预处理0.5 h 后再给予LPS 干预，
CD11b 表达明显减少，说明Gen 能抑制LPS 诱导的小胶质细胞激活。随后我们观察NLRP3炎症小体信号通路的
变化，NLRP3免疫荧光强度、casapse-1活性和IL-1β分泌在LPS 刺激后明显升高或增加，Gen 预处理可显著降低NLRP3免疫荧光强度、casapse-1活性和减少IL-1β分泌，证实Gen 对LPS 诱导小胶质细胞NLRP3炎症小体活化具有明显抑制作用。由于线粒体来源的ROS 可以激活NLRP3炎症小体[1, 13]，我们因此检测了线粒体膜电位和线粒体ROS 的变化。LPS 刺激后小胶质细胞线粒体膜电位下降，线粒体和细胞内ROS 均升高，Gen 预处理明显逆转上述改变，推测Gen 可能通过减少线粒体损伤、降低线粒体ROS 水平、抑制NLRP3炎症小体活化、减少IL-1β分泌等发挥抗炎作用。
综上所述，本研究显示Gen 可显著抑制LPS 诱导的小胶质细胞激活，该作用可能与调控NLRP3炎症信号通路有关，但具体作用机制还需要进一步实验证明。
注：A. JC-1检测小胶质细胞线粒体膜电位的变化；B. MitoSOX TM 红试剂检测小胶质细胞线粒体内ROS 的变化；C. CM-H2DCFDA 检测小胶质细胞胞内ROS 的变化。①P =0.014，③P =0.011，⑤P =0.
004，与对照组比较；②P =0.033，④P =0.010，⑥
P =0.019，与LPS 组比较。图3  Gen 对LPS 诱导小胶质细胞线粒体膜去极化和线粒体ROS 积聚的影响
Fig 3
Effect of Gen on LPS-induced mitochondrial depolarization and mitochondrial ROS accumulation in microglia
A B C
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参·考·文·献
[收稿日期][本文编辑]
2018-12-24瞿麟平

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