氧化应激涉及细胞内活性氧（ROS ）水平升高，从而破坏各种生物分子，特别是核酸，蛋白质和脂质的变化，
引起细胞损伤［1］
，最终导致细胞死亡。ROS 的过量产生
或消除不足可引发多种疾病，例如神经退行性变［2］
、心血管疾病［3］和肝病［4］。Parthanatos 是一种新的细胞程序性死亡形式，N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG ）诱发的ROS 产生可导致DNA 损伤和聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）活化，PARP-1活化进一步介导了
parthanatos ［5］。细胞中PARP-1的激活、多聚ADP 核
糖（PAR ）的聚集以及凋亡诱导因子（AIF ）的入核［6］被认为是细胞发生parthanatos 的三大典型特征［7］。Parthanatos 与ROS 的生成和DNA 损伤有着密切联系，在脑缺血再灌注、失血性休克、帕金森氏病和阿尔茨海
默病中起着重要作用［8-10］
。
高丽参中含有丰富的活性物质如皂苷、多糖、蛋白、氨基酸、多肽、挥发油、维生素、无机元素等，具有极高的
药用价值［11-13］
。目前研究发现，高丽参具有抗癌、抗糖尿病和抗炎作用［14-15］。高丽参可通过抑制ROS 的产生或清除ROS ，激活抗氧化防御系统，维持氧化还原状态，有
效地保护细胞免受氧化应激诱导的细胞损伤［16-17］
。已有研究发现人参的主要成分人参皂苷，在神经退行性疾
病、脑缺血再灌注等具有神经保护作用［18］
。但高丽参是否
Effect of hot water extract of Korean ginseng on neuroblastoma cell parthanatos
GUO Yuanbo 1,ZHANG Dengwen 1,LONG Ruichun 1,SHAN Songgui 2,SUN Qiang 1,CAI Bin 1,WANG Sheng 1
1
Department of Anesthesiology,2Department of Science and Education,Guangdong Provincial People's Hospital/Guangdong Academy of Medical Sciences,Guangzhou 510080,China
摘要：目的探讨高丽参热水提取物预处理对N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG ）诱导神经母细胞瘤（SH-SY5Y ）细胞
parthanatos 的影响及其机制。方法将SH-SY5Y 细胞分为空白组、MNNG 诱导组及高丽参热水提取物预处理组，空白组细胞不给予任何处理，MNNG 诱导组给与MNNG 250μmol/L 刺激1h 或4h ，高丽参热水提取物预处理组在给与MNNG 诱导前先给与高丽参热水提取物1mg/mL 预处理。以CCK-8和细胞流式技术检测细胞存活率，Western blot 检测PAR 蛋白，免疫荧光检测AIF 核质分布，细胞流式技术检测细胞活性氧的表达。结果与空白组比较，SH-SY5Y 细胞的存活率随着MNNG 刺激的浓度和时间的增加而逐渐降低（P <0.05）；MNNG 刺激SH-SY5Y 后多聚PAR 蛋白表达增加（P <0.05）；高丽参热水提取物
预处理可以抑制MNNG 诱导的SH-SY5Y 死亡，并且降低了MNNG 诱导的AIF 的表达和入核（P <0.05）；MNNG 刺激后活性氧的表达增加，而高丽参热水提取物预处理后，活性氧的表达显著降低（P <0.05）。结论高丽参热水提取物预处理SH-SY5Y 细胞可以降低活性氧的产生并降低了MNNG 诱导的parthanatos 的发生。关键词：高丽参；热水提取物；parthanatos ；细胞活性氧；多聚（ADP-核糖）；凋亡诱导因子
Abstract:Objective To explore the effect of pretreatment of neuroblastoma cells with hot water extract of Korean ginseng on MNNG-induced parthanatos and its mechanism.Methods Neuroblastoma SH-SY5Y cells were pretreated with 1mg/L hot water extract of Korean ginseng before induction with 250μmol/L MNNG for 1h or 4h.CCK-8and cell flow cytometry were used to detect cell survival rate.Western blotting was used to detect the changes in poly(ADP-ribose)(PAR)expression in the treated cells.Immunofluorescence assay was used to detect nuclear distribution of apoptosis-inducing factor (AIF),and flow cytometry was used to detect the level of reactive oxygen species (ROS)in the cells.Results Compared with the blank control cells,MNNG-treated SH-SY5Y cells showed significantly decreased survival rate as the concentration of MNNG and the stimulation time increased (P <0.05).Stimulation with MNNG also resulted in significantly increased expression of PAR protein in the cells (P <0.05).Pretreatment of the cells with hot water extract of Korean ginseng obviously inhibited M
NNG-induced cell death and significantly reduced AIF expression and nucleation in the cells (P <0.05).MNNG stimulation significantly increased ROS level in the cells,which was decreased significantly by pretreatment of the cells with the extract (P <0.05).Conclusion Pretreatment with hot water extract of Korean ginseng reduces MNNG-induced parthanatos and ROS production in SH-SY5Y cells.
Keywords:Korean ginseng;hot water extract;parthanatos;reactive oxygen species;poly(ADP-ribose);apoptosis-inducing factor
收稿日期：2020-05-10
基金项目：广东省中医药局科研项目（20191006）；广东省医学科研基金（A2020038）；广东省基础与应用基础研究基金项目（2019A1515110063）作者简介：郭远波，硕士，主治医师，E-mail:********************通信作者：王晟，博士，博士生导师，主任医师，E-mail:shengwang_gz@163
J South Med Univ,2020,40(9):1313-1318doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2020.09.14
·
·
1313
可以通过ROS 影响parthanatos 起到神经保护作用，其可能的机制如何，目前尚不清楚。本研究通过MNNG 诱导神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y ）的parthanatos ，观察并初步探索高丽参热水提取物对ROS 引发parthanatos 的影响和机制研究。
1材料和方法1.1试剂
N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍MNNG （meilunbio ）；CCK-8试剂盒（MCE ，Cat.No.HY-K0301）；Annexin V FITC Apoptosis Kit 凋亡试剂盒（BD 556547）；PAR-4Antibody （CST#2328）；AIF （D39D2）Rabbit mAb （CST #5318）；DCFDA /H2DCFDA-Cellular ROS Assay 试剂盒（ab113851）；各种酶及培养基。1.2分组与模型
1.2.1SH-SY5Y 细胞分成7组空白对照组，MNNG 10μmol/L 组、50μmol/L 组、100μmol/L 组、250μmol/L 组、500μmol/L 组、1000μmol/L 组，从而确定MNNG 刺激细胞的浓度。
1.2.2SH-SY5Y 细胞分成8组MNNG 0h 组、1h 组、2h 组、3h 组、4h 组、6h 组、8h 组、10h 组，MNNG 250μmol/L 分别刺激以上不同时间，从而确定MNNG 刺激细胞的有效时间。
1.2.3SH-SY5Y 细胞分成5组MNNG 0min 组、20min 组、30min 组、45min 组、60min 组，MNNG 250
μmol/L 刺激SH-SY5Y 细胞检测parthanatos 相关蛋白PAR 。1.2.4SH-SY5Y 细胞分成8组空白对照组，高丽参热水提取物0mg/mL 组、0.01mg/mL 组、0.1mg/mL 组、1mg/mL 组、10mg/mL 组、50mg/mL 组、100mg/mL 组。不同浓度高丽参热水提取物预处理后，给予MNNG 250μmol/L 刺激细胞4h ，从而确定高丽参热水提取物对细胞发生parthanatos 后的影响，并确定其有效浓度。
1.2.5高丽参热水提取物预处理SH-SY5Y 细胞后产生ROS
和parthanatos 的相互关系高丽参热水提取物1mg/mL 预处理SH-SY5Y 细胞后，给予MNNG 250μmol/L 刺激细胞30min 或者1h ，检测空白组与实验组各组细胞ROS 的含量。1.3方法
1.3.1CCK-8实验检测SH-SY5Y 细胞存活率96孔板中的SH-SY5Y 细胞处理后，每孔加入10μL CCK-8溶液，温箱内孵育2h ，酶标仪450nm 处测吸光度A 450nm ，换算细胞存活率。
1.3.2细胞流式技术检测SH-SY5Y 细胞存活率将处理好的SH-SY5Y 细胞消化离心后，先加入5μLAnnexin V FITC 混匀，室温避光孵育15min ，再加入5μL 碘化丙啶室温避光孵育5min 后，流式细胞仪检测细胞死亡率。1.3.3细胞内PAR 的表达检测充分裂解处理好的SH-SY5Y 细胞，BCA 法检测蛋白浓度，采用Western blot 法检测PAR 蛋白的表达。凝胶电泳后转膜，电化学发光液曝光，采用Image J 软件进行灰度值分析，以目的蛋白与内参三磷酸甘油醛脱氢酶的灰度值比值表示目的蛋白表达量，并以正常组作为对照。
1.3.4细胞内AIF 核质分布检测通过细胞免疫荧光检测不同处理组发生parthanatos 后AIF 的核质分布情况。1.3.5细胞内ROS 检测处理后的SH-SY5Y 细胞，加入10μmol/L 的H2DCFDA 混匀，37℃孵育30min ，激光共聚焦显微镜观察，流式细胞仪进行荧光定量检测。1.4统计学处理
应用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较使用单因素方差分析和LSD 多重比较法，P <0.05为差异有统计学意义。2结果
2.1MNNG 刺激使SH-SY5Y 细胞的死亡率升高
CCK-8实验和细胞流式结果显示：与空白对照组比较，SH-SY5Y 细胞的存活率随着MNNG 刺激的浓度和时间的增加而逐渐降低（P <0.05，图1）。
MNNG concentration (μmol/L)
******
**
*
1.2
1.00.80.60.40.20C e l l v i a b i l i t y % 1.2
1.00.80.60.40.20
MNNG (250μmol/L)
1
2346
8
10
图1MNNG 刺激使SH-SY5Y 细胞的死亡率升高
Fig.1MNNG stimulation increases SH-SY5Y cell mortality.A :Relationship between MNNG concentration and cell viability;B :Relationship between the stimulation time of 250μmol/L MNNG and cell viability.*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001vs control
A B J South Med Univ,2020,40(9):1313-1318www.j-smu
Control
10
50
100
250
500
1000
Stimulation time (h)
·
·1314
2.2MNNG 诱导SH-SY5Y 细胞发生parthanatos
Western blot 结果显示：与空白对照组比较，MNNG 刺激后SH-SY5Y 细胞内多聚PAR 蛋白表达增加，且在MNNG 刺激时间为20~30min 时PAR 表达增加最为明显（图2）。
2.3高丽参热水提取物能降低MNNG 诱导的SH-SY5Y
细胞的死亡率
CCK-8实验结果显示：用250μmol/L MNNG 刺激SH-SY5Y 4h 后，与未加高丽参热水提取物预处理组比较，高丽参热水提取物预处理组的SH-SY5Y 细胞的存活率提高，并且随着高丽参热水提取物预处理的浓度增高其存活率逐渐升高（P <0.05，图3）。
2.4高丽参热水提取物能降低MNNG 诱导的PAR 蛋白
的表达
Western blot 结果显示：用MNNG 250μmol/L 处理SH-SY5Y 细胞20或30min ，与对照组相比PAR 蛋白表达升高，而用高丽参热水提取物1mg/mL 处理则可以显著减少MNNG 引起的PAR 蛋白的表达（P <0.05，图4）。
2.5高丽参热水提取物能降低MNNG 诱导的AIF 的表达和入核
细胞免疫荧光共聚焦结果显示：与空白对照组比较，MNNG 刺激后AIF 的表达以及入核荧光强度明显增强，而加入高丽参热水提取物预处理后，MNNG 引起的AIF 的表达减少，并且其入核荧光强度也明显减弱（图5）。
2.6高丽参热水提取物通过抑制ROS 的生成并减少parthanatos
ROS 荧光定量细胞流式结果显示：与空白对照组相比，MNNG 刺激后ROS 的表达增加，但加入高丽参热水提取物预处理后，ROS 的表达与单独MNNG 处理组比较明显减少（图5）。3讨论
对高丽参热水提取物的抗氧化作用研究，本研究进行了体外细胞预实验结果发现，使用MNNG
能够诱导
图2MNNG 刺激后SH-SY5Y 细胞内多聚PAR 蛋白表达增加
Fig.2Increased expression of poly(ADP-ribose)(PAR)protein in SH-SY5Y cells after MNNG stimulation.*P <0.05,**P <0.01vs 0min.
PAR
gapdh
20
30
45
60(min)
2.5
2.0
1.51.0
0.50
P A R /g a p d h
20304560
PAR (MNNG 250μmol/L)
**
**
*
*
A
B 图3高丽参热水提取物能降低MNNG 诱导的SH-SY5Y
细胞的死亡率
Fig.3Hot water extract of ginseng reduce the death rate of SH-SY5Y cells induced by MNNG.
1.21.0
0.80.60.40.20C e l l v i
a b
i l i
t
y %
MNNG (250μmol/L)4h
**
**
*
*
Control
00.010.111050100
Korean ginseng hot water extract (mg/mL)
PAR
gapdh
---++-++++
20
30
20
30(min)
Korean ginseng
MNNG
A
B
2.52.0
1.51.00.50
P A R /g a p d h
**
**
K
o r e a n g i n s e n g +M N N G 30m i n K o r e a n g i n
s e n g +M N N G 20m i n M N N G 30m i n M N N G 20m i n N C 图4高丽参热水提取物可以降低MNNG 诱导的
PAR 的表达
Fig.4Hot water extract of ginseng reduces the expression of PAR induced by MNNG.**P <0.05.
www.j-smu J South Med Univ,2020,40(9):1313-1318
Stimulation time (min)
·
·1315
细胞发生经典的parthanatos死亡，包括PAR的聚集及AIF入核等，而这些效应均能被高丽参热水提取物显著的抑制，提示了高丽参热水提取物具有抑制parthanatos 发生的效应。
Parthanatos是一种新的程序性细胞死亡方式，主要以DNA损伤，PARP-1激活为主要特征，当有轻度DNA 损伤时，PARP-1的活性增加至500倍，酶利用ATP的消耗产生的氧化NAD（NAD+）来合成PAR聚合物［7］。然而，当DNA损伤较深时，PARP-1过度激活，AIF从线粒体向细胞核的移位，大规模DNA片段化（约50kb）和染质浓缩，然后是细胞死亡［19-21］。MNNG可引起过量的DNA链断裂，导致PARP-1过度活化发生parthanatos。有研究发现MNNG诱导的parthanatos伴随着双相ROS 产生和胞内钙增加，由MNNG触发的ROS产生而导致增强的DNA损伤和PARP-1的激活。此外，细胞内钙升
高和ROS产生具有相互扩增作用，从而有助于PARP-1介导的parthanatos［5］。本实验结果也表明MNNG能通过增加ROS的产生和AIF核易位来诱导SH-SY5Y细胞parthanatos的发生。
氧葡萄糖剥夺触发了SH-SY5Y细胞中的parthanatos，而抗氧化剂NAC抑制ROS的过量生产，从而明显减弱了氧葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞中的parthanatos［22］。另有研究也同样证明了通过诱导过量ROS产生可以促进由氧化应激引起的神经胶质瘤细胞触发parthanatos［23-24］。通过细胞内活性氧ROS的检测，本研究发现高丽参热水提取物可以抑制ROS的产生，AIF核易位减弱，同时减少MNNG诱导的SH-SY5Y发生parthanatos。
有研究证明，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）
氧化酶具有跨膜运输电子和产生超氧化物和
AIF DAPI Merge
图5高丽参热水提取物可以抑制MNNG诱导的AIF的表达和入核
Fig.5Hot water extract of ginseng inhibits the expression of AIF induced by MNN(Original
magnitication:×400).
Control
MNNG1h
Korean ginseng hot
water extract and
MNNG1h
9.75%34.3%54.8%66.5%77.4%79.4%
Control MNNG50μmol/L MNNG100μmol/L MNNG250μmol/L MNNG500μmol/L MNNG1000μmol/L ▲
▲
P
I
FITC
图6高丽参热水提取物预处理抑制了MNNG诱导的ROS产生
Fig.6Pretreatment of ginseng hot water extract inhibits ROS production induced by MNNG.
J South Med Univ,2020,40(9):1313-1318www.j-smu ·
·1316
其他下游ROS的能力［25］，尤其是能以NADPH氧化酶4依赖性的方式增加了细胞中ROS的产生［26-29］。而身体运动训练减少了NADPH氧化酶的表达，导致局部ROS 生成减少［28,30］，说明NADPH氧化酶的增加或减少对ROS的生成多少有重要影响。本研究发现高丽参热水提取物可以减少MNNG诱导的ROS产生，但是其引起ROS生成减少的机制是否是通过抑制NADPH氧化酶的产生暂未进行深入探究。
有研究发现高丽参主要成分人参皂苷可通过抑制线粒体肿胀、保存线粒体膜电位和减少ROS的产生，保护分离的线粒体免受钙离子诱导的损伤，减少线粒体释放细胞素c和AIF，从而减少缺血后线粒体介导的凋亡，起到对短暂性局灶性脑缺血的神经保护作用［29,31］。也有文献报道参皂苷Rg1能提高H2O2损伤的SH-SY5Y 细胞的存活率，减少乳酸脱氢酶漏出量，提高超氧化物歧化酶活性，能有效抑制caspase-3的免疫反应，并呈剂量依赖性参与热休克蛋白70基因的表达［30］。有研究也发现，高丽参茶可以通过降低谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶，对低灌注或再灌注性脑损伤具有保护作用，提示高丽参茶对脑血管病（包括脑卒中）
具有作用［31］。那么，高丽参热水提取物中的什么成分对MNNG刺激后SH-SY5Y细胞的死亡率降低起着主导作用呢？高丽参热水提取物抑制SH-SY5Y细胞的死亡是否也存在其他机制可以解释呢？还需要更进一步的研究成果进行探究。
综上所述，高丽参热水提取物可能通过抑制MNNG诱导的ROS生成，减少DNA损伤和PAR形成这一机制来抑制SH-SY5Y细胞发生的parthanatos。这一发现对高丽参等参类在抑制氧化应激的机制方面做了补充，另外可能对中草药在氧化应激疾病的临床用药和方面有一定的借鉴意义。关于高丽参热水提取物对parthanatos的具体机制接下来将会做进一步深入的研究。
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