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1Ra（recombinant human IL-1Ra，rhIL-1Ra）是已经被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床风湿性关节炎的药物。动物实验表明，rhIL-1Ra能显著提高化学药物诱导ALF小鼠的存活率[6-7]。rhIL-1Ra是否通过直接作用于肝实质细胞发挥抗肝细胞凋亡作用尚不清楚。肝母细胞瘤HepG2细胞仍然保留肝实质细胞的特征，如药物代谢系统、血清蛋白分泌和支持乙型肝炎病毒增殖等特点，其被广泛地用于建立肝损伤体外细胞模型和体外评价药物护肝效果方面的研究[8-9]。
本研究利用D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）处理HepG2细胞，观察细胞形态及生存率的变化，构建体外肝损伤细胞模型。通过检测rIL-1Ra对损伤模型细胞的存活率和细胞凋亡水平的影响来评价rhIL-1Ra对肝细胞的直接保护效果。此外，本研究考察rhIL-1Ra对损伤模型细胞内的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），凋亡诱导相关细胞因子白介素1β （interleukin-1β，IL-1β）、白介素6 （interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的mRNA水平及抗凋亡蛋白的影响来揭示rhIL-1Ra保护肝细胞损伤作用的分子机制。
1材料与方法
1.1  材料
人肝母细胞瘤HepG2细胞株购于中国科学院细胞库，DMEM高糖培养基和胎牛血清（FBS）均购于美国Thermo Fisher Scientific公司，rhIL-1Ra购于上海伍洋生物医药有限公司，D-GalN购于美国Sigma-Aldrich公司，Cell Counting Kit-8购于日本东仁化学科技（上海）有限公司，Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司；Hoechst 33342购于上海Sigma-Aldrich贸易公司，ROS检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司，总RNA提取试剂盒购于康为世纪有限公司，RNA反转录试剂盒购于宝日医生物技术有限公司，Fast Start Universal SYBR Green Master购于瑞士罗氏公司，ERK1/2抑制剂SCH772984购于美国MedChemExpress公司，ERK、p-ERK、β-actin一抗和二抗均购于美国Cell Signaling Techology公司。
1.2  方法
1.2.1细胞培养与处理HepG2细胞培养在含有10% FBS 的DMEM高糖培养基中，培养条件为37 ℃、5% CO2。建立D-GalN诱导肝细胞损伤模型时，将HepG2细胞接种
于96孔板中（4×104/孔）；培养过夜后，在各细胞的培养基中分别添加0.02、0.2、2、4 mg/mL D-GalN，每种浓度5个复孔；细胞加药后继续培养，分别在第1、2和3日时观察细胞形态变化，并用CCK-8试剂盒分析细胞活力变化。细胞凋亡检测、ROS水平测定和荧光实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析样品进行细胞处理时，将HepG2接种于6孔板中（1×106/孔），过夜培养后，按
照正常对照组（PBS对照）、D-GalN组（4 mg/mL）、rhIL-1Ra处理组（D-GalN 4 mg/mL，rhIL-1Ra 50 μg/mL）进行加药后继续培养，按照分析要求进行采样。
1.2.2rhIL-1Ra对D-GalN诱导损伤模型肝细胞的保护作用将HepG2细胞接种于96孔板（4×104/孔）中过夜培养，细胞被分为模型对照组（D-GalN）和rhIL-1Ra 处理组（D-GalN结合10、20、50 μg/mL的rhIL-1Ra，即先加入rhIL-1Ra，1 h后加入D-GalN，如果观察超过1 d，每隔24 h换液和重新加药1次）。分别于加药后的1、2 d观察细胞变化及用CCK8试剂盒测定细胞存活率。
1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡细胞被加药处理48 h 后，收集各组细胞，按照Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒说明书操作。用冷PBS进行洗涤后，用FITC标记的Annexin V和PI染液染后，采用CytExpert流式细胞仪（美国贝克曼公司）在1 h内检测。
1.2.4 ROS水平测定将HepG2接种于6孔板中（1×106/孔），过夜培养后，按照正常对照组（PBS对照）、D-GalN组（4 mg/mL）、rhIL-1Ra处理组（D-GalN 4 mg/mL，rhIL-1Ra 50 μg/mL）进行加药后继续培养6 h；用活性氧探针（DCFH-DA）标记细胞15 min，用冷PBS 洗涤细胞后，加入 Hoechst 33342（5 μg/mL）染2 min，用PBS洗涤3次后，在荧光显微镜下观察和分析荧光强度变化情况。
1.2.5qRT- PCR分析将HepG2接种于6孔板中（1×106/孔），过夜培养；按照正常对照组（PBS对照）、D-GalN组（4 mg/mL）、rhIL-1Ra处理组（D-GalN 4 mg/ mL，rhIL-1Ra 50 μg/mL）加药后继续
培养48 h；收集细胞，用冷PBS洗涤，提取各组细胞的总RNA，并对总RNA的浓度进行测定和质量检测；用TAKARA的反转录试剂盒合成cDNA；根据Fast Start Universal SYBR Green Master 试剂盒要求，用ABI荧光定量PCR仪进行qRT-PCR，检测每组细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平，引物序列见表1；每组3个复孔，以β-actin为内参[10-11]，PCR结果采用△△C t法计算mRNA相对表达水平。
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1.2.6 SCH772984抑制IL-1Ra 的保护作用观察 将细胞分别接种于96孔板（4×104/孔）和6孔板（1×106/孔）中，分为正常对照组、肝细胞损伤组（D-GalN ）、rhIL-1Ra 组（D-GalN +rhIL-1Ra ）、SCH772984组（肝损伤细胞模型+rhIL-1Ra +SCH772984）、DMSO 对照组（与SCH772984等体积的DMSO ）。过夜培养后，SCH772984组和DMSO 组分别加入抑制剂或DMSO 预处理培养24 h ，各实
验组再加入相应的药物，继续培养24 h ，检测细胞存活率变化。同时，分别收集6孔板中各组细胞总蛋白，Western blotting 分析ERK1/2蛋白水平和磷酸化水平
（phosphorylation-ERK1/2，pERK1/2）的变化。
1.3  统计学分析
采用SPSS 16.0和GraphPad 5.0软件进行统计分析，数据以x —
±s 形式表示。2组比较采用两独立样本的t 检验，多组比较采用χ2检验，P <0. 05表示差异具有统计学意义。
2  结果
2.1  D-GalN 诱导的肝细胞损伤模型的建立
正常组细胞呈梭形并聚集生长，胞体形态饱满，立体感较强。0.02、0.2 mg/mL D-GalN 组细胞状态和形态均没
有明显变化。2、4 mg/mL D-GalN 组细胞内空泡增多（脂滴增多），代谢异常，并随着时间的变化细胞
明显变圆，细胞间连接减少，非贴壁细胞较多；4 mg/mL 的D-GalN 组的细胞变化更为明显（图1A ）。细胞存活率检测结果显示，在加药后的第2日各组显示出较大差异，对照组与4 mg/mL D-GalN 组比较，差异有统计学意义[ （100.00±2.41） % vs
（49.13±0.75） %，P=0.000]（图1B ）。表1  qRT-PCR 引物序列
Tab 1
Primers of qRT-PCR
IL-1β正向引物5′-TTGTTGCTCCATATCCTGTCC-3 ′注：
A.细胞形态变化（标尺为100 μm ）；
B.细胞存活率变化（①P=0.032，②P=0.017，③P=0.009，④P=0.017，⑤P=0.005，⑥P=0.000，与正常对照组比较）图1  不同浓度D -GalN 下HepG 2细胞的形态和存活率变化
Fig 1  Morphology and cell viability of HepG 2
cells at different concentration of D-GalNreactive oxygen species (ros)
A
B
郑 滢，等    重组人白介素1受体拮抗剂对肝细胞的保护作用
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2.2  rhIL-1Ra促进D-GalN诱导的肝损伤细胞存活
模型组的细胞在第2日时，细胞明显皱缩变形，连接
减小，非贴壁细胞增多。加入10 μg/mL rhIL-1Ra后有效
减轻D-GalN对HepG2细胞的损伤和形态改变，50 μg/mL
rhIL-1Ra组细胞与正常对照组相似（图2A）。在细胞存
活率方面， rhIL-1Ra处理组与D-GalN模型组的细胞相比，
50 μg/mL rhIL-1Ra处理组在24 h后显著提高HepG
2细胞
的存活率，并随着rhIL-1Ra的浓度增加，细胞存活率均
显著增高。第2日，D-GalN组与50 μg/mL rhIL-1Ra组比
较，细胞存活率的差异有统计学意义[（55.21±3.99）% vs
（85.54±3.08）%，P=0.009]（图2B）。该结果显示，rhIL-
1Ra对D-GalN诱导的肝细胞损伤模型具有保护作用，并
呈浓度梯度依赖性。
注：A.细胞形态变化（标尺100 μm）；B.细胞存活率变化；（①P=0.018，②P=0.009，③P=0.003，④P=0.024，⑤P=0.011，⑥P=0.003，与模型组细胞比较）图2不同浓度rhIL-1Ra下HepG2的细胞形态和存活率变化
Fig 2  Morphology and cell viability of HepG
2
cells at different concentration of rhIL-1Ra
2.3  rhIL-1Ra减少D-GalN诱导的肝细胞凋亡
采用流式细胞仪分析各组细胞凋亡情况，结果显示，正常对照组的凋亡细胞比例为13.61%，D-GalN肝细胞损伤组的凋亡细胞比例显著增加，为32.25%。加入rhIL-1Ra后可以明显减轻D-GalN对肝细胞的损伤，凋亡细胞比例降低至19.61%；与模型组相比，死亡细胞的比例也有所下降（4.36% vs 3.01%）（图3）。
A
B
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2.4  IL-1Ra 降低ROS 水平
在D-GalN 诱导的肝细胞损伤模型中，肝细胞损伤组与正常对照组相比，细胞内的ROS 水平明显升高
（0.068±0.011 vs  0.345±0.073，P=0.023）；而rhIL-1Ra 处理组与肝细胞损伤组相比，细胞内ROS 荧光强度明显降低（0.345±0.073 vs 0.141±0.029，P=0.021）（图4）。
注：
A ～C. 流式细胞检测结果；D.各期细胞的比例图3  rhIL -1Ra 对D -GalN 诱导的HepG 2细胞凋亡的影响
Fig 3  Effect of rhIL-1Ra on D-GalN-induced apoptosis in HepG 2 cells
注：蓝荧光为Hochest 标记细胞核，红荧光为细胞内的ROS 探针DCF 信号；标尺为100 μm 图4  HepG 2细胞内ROS 水平变化
Fig 4  ROS level in HepG 2
cells
2.5    I L-1Ra 通过降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平保护细胞
与正常对照组比较，D-GalN 诱导的肝损伤模型细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA 水平均显著升高；而
rhIL-1Ra 可以显著抑制D-GalN 诱导的肝损伤模型细胞中3种促凋亡细胞因子的表达水平（图5）
。
A B C
D
郑 滢，等    重组人白介素1受体拮抗剂对肝细胞的保护作用

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