实验单元3：鱼类氧化应激指标的测定
学号No.： 2014308110001   姓名Name： 程辉辉   日期Date： 2015.3.21
摘要：鱼体在受到外界刺激的时候，组织或细胞内氧自由基生成增加，清除能力降低，导致活性氧在组织或细胞内蓄积而引起氧化损伤。而活性氧的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化。蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。而衡量脂质过氧化的指标便是丙二醛，其是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标。在本实验中，我们主要探究了脂质过氧化和蛋白羰基化的测定方法，以便更好的定量衡量氧化应激的程度。实验中所测得的肌肉蛋白质羰基含量为727.92 nmol/mg prot，肝脏蛋白质羰基含量为1142.41 nmol/mg prot，肌肉MDA含量为0.011 nmol/mg prot，肝脏MDA含量为0.14 nmol/mg prot，相比其他的实验，所测定结果相差较大。在实验中存在诸多操作失误，希望能在以后的实验中引以为戒，为实验室条件下对鱼类的氧化应激水平奠定实验和操作基础。
关键词：应激；蛋白质定量；蛋白质羰基化；脂质过氧化
【前言】
随着集约化养殖的发展，鱼类在养殖过程中遭受到的应激因素日益增多。人为活动、外界环境的变化、饵料和水体中的有害物质均会对鱼体产生应激。氧化应激反应是有氧生物不可避免的，它是生物体的活性氧簇( reactive oxygen species，ROS)和抗氧化防御系统之间不平衡的结果。ROS是过渡金属离子、农药、石油污染物等物质诱导产生的。自由基是正常细胞新陈代谢过程中由内源性细胞产生的。线粒体呼吸是 ROS 主要的内源性来源（李学彬，2009）。ROS 的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化，基因表达的改变以及细胞氧化还原状态的变化。
在生物体内，很多脂类含有多不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，很易受到过氧化作用损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物。这些化合物能破坏人体细胞正常生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。丙二醛（MDA）是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标，其含量能直接反映机体脂质过氧化程度，并间接反映细胞损伤程度（刘淑兰，2012）。
脂质过氧化的测定通常是通过TBA试验来完成的，其主要应用于食品和生物材料中脂类氧化检测和定量。硫代酸法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反应，形成氧化自由基而氧化
生成环氧化合物，环氧化合物分解生成丙二醛（MDA），MDA与硫代酸（TBA）作用生成TBA染料配合物，此化合物在532nm 下有最大吸收值。通常测试结果表示为532nm下吸光值与丙二醛吸光系数之积，即通常所说TBA值。
蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标。蛋白质羰基在体内的形成主要是通过金属离子催化氧化系统（MCO系统)完成的。在这个过程中，Fe2+和Cu2+可以结合在蛋白质的阳离子结合位点。被H2O2或O2攻击之后将侧链含有氨基的氨基酸羰基化（曹溪青，1985）。此外, 羟自由基也可直接作用于肽链, 使肽链断裂, 引起蛋白质一级结构的破坏, 在断裂处产生羰基。目前，大量的研究证明了氧化损伤与衰老和疾病的关系。
实验中采用的蛋白质羰基化的测定方法是2, 4 -二硝基苯肼（DNPH)比法，这是一种是测定蛋白质羰基含量的经典方法。被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应生成红棕沉淀2,4-二硝基苯腙，将沉淀用盐酸胍溶解后即可读取370nm下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。
【材料与方法】
选取均重200g左右的鲫鱼，解剖鱼体，暴露内脏，切离部分肝脏和肌肉组织，然后将其转入玻璃匀浆器中，按照1:9（W/V）比例加入PBS（匀浆介质），充分研磨均匀，制成组织匀浆液（冰水浴中进行）。
1.匀浆蛋白浓度测定
取约0.5g组织样品，以1:9比例加入PBS进行研磨得到组织匀浆。取组织匀浆上清稀释十倍后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。
2.脂质过氧化测定
• 将MDA标准品浓度（10 nmol/mL）稀释到0,1,2.5,5,7.5,10 nmol/mL；
• 取0.2 mL稀释40倍的未离心的匀浆液和不同浓度的MDA标准品，分别与0.8 mL的0.53% TBA混匀，于95℃孵育60 min，4℃15000 g离心15 min，取上清，测定532 nm处的吸光值（一定要保证管口的密封性）
• 以MDA浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到MDA浓度与吸光值关系的公式。
• 以样品吸光值带入上述公式，计算样品中的MDA浓度为CMDA（nmol/mL）
• 组织中MDA含量（nmol/mg prot）=[CMDA(nmol/mL)]/[Protein mg/ml]
3.组织蛋白质羰基化测定
• 取稀释后的上清50μL，在上清中加入50μL的10mmol/L的DNPH作为试验管，另取稀释后上清50μL，加入50μL的2.5mmol/L的HCI作为空白管。
• 将各管置于冰盒中避光放置1h，每隔15min涡旋振荡混匀一次。
• 反应完后加入25μL 50%（W/V）的三（TCA）溶液来沉淀蛋白质衍生物，4℃ 12000g离心15min，弃上清。沉淀用200μL乙醇和乙酸乙酯的混合物（V：V=1:1）洗涤（4℃ 12000g离心15min），最后沉淀用400μL6mol/L盐酸胍溶解（37℃，15min）。之后于12000g离心15min，取上清，测定370nm处吸光值。
• 计算：羰基浓度（nmol/mL）=[CA/22000]×106×(Vfinal/ Vsample)
• CA=实验组吸光值-对照组吸光值
Vfinal是指终体系的体积；Vsample是指所加入的样品体积
蛋白质浓度（nmol/mg protein）=(Carbonyl nmol/ml)/(Protein mg/ml)
【实验结果与分析】
1.匀浆蛋白浓度的测定结果
羰基
MDA
肝脏
肌肉
肝脏
肌肉
OD值
0.5337
0.4809
0.51685
0.5744
蛋白浓度(mg/ml)
46.95
22.48
39.14
65.82
根据以上标准曲线，本组所测定的蛋白质羰基测定过程中肝脏蛋白浓度为46.95mg/ml，肌肉蛋白浓度为22.48mg/ml，MDA测定过程中肝脏蛋白浓度为39.14mg/ml，肌肉蛋白浓度为65.82mg/ml。
2.MDA的测定
本组所测定的肌肉MDA含量为0.011 nmol/mg prot，肝脏MDA含量为0.14 nmol/mg prot。
3.蛋白质羰基化的测定
本组所测定的肌肉蛋白质羰基含量为727.92 nmol/mg prot，肝脏蛋白质羰基含量为1142.41 nmol/mg prot。
【讨论】
实验过程中测定的脂质过氧化所产生的MDA含量与复合污染条件下鲫鱼组织脂质过氧化中肝脏MDA含量（1.18~1.59nmol/mg prot）（贾秀英，2003）及亚硝酸盐胁迫条件下鲫鱼肝胰脏组织MDA含量（1.18±0.24nmol/mg prot）（谭树华，2005）相对比，结果的差异性较大，
可以认为本次测定结果为错误，主要是因为测定过程中，测定的步骤与蛋白质羰基化的步骤混杂，且操作的过程不规范，因此造成了实验结果的错误。
蛋白质羰基含量测定结果与镉胁迫条件下瓯江彩鲤脏器组织蛋白质羰基含量（0.68-2.07nmol/mg prot）（刘晓旭，2011reactive carbonyl species）相差太大，可以认为此次实验的结果不可靠。
两次的实验过程中，我们所测定的结果发生错误原因很多：第一，操作的过程不规范，如避光处理并未达到避光的要求；第二，实验步骤混乱，两个实验并行穿插以后，实验的步骤显得十分的混乱；第三，对实验过程的把握程度不够，故而造成了上述的结果，希望能在以后的实验中引以为戒。
参考文献：
1. 李大鹏, 李莉, 汤蓉, 迟巍, 胡青, 刘子栋, 尹晓燕. 动物生理生化研究法[M]. 华    中农业大学水产学院.
2. 李学彬. 苯二甲酸二乙基己醋对金娜鱼的氧化损拐作用的研究[D]. 武汉:华中师范大学, 2009.
3. 刘淑兰. 氧化应激对鱼类的影响[J]. 饲料工业, 2012, (2): 48-52.
4. 曹溪青. 脂质过氧化对细胞机体的作用[J]. 中国协和医科大学学报, 1985, (1): 17-23.
5. 贾秀英, 董爱华. 复合污染对鲫鱼组织脂质过氧化的影响[J]. 浙江大学学报, 2003, 29(3): 325-328.
6. 谭树华, 何典翼, 严芳, 等.亚硝酸钠对鲫鱼肝脏丙二醛含量和总抗氧化能力的影 响[J]. 农业环境科学学报, 2005, 24（增刊）:21-24.
7. 刘晓旭, 曹慧, 贾秀英. 镉对瓯江彩鲤脏器组织蛋白质的氧化损伤作用[J]. 生态毒理学报, 2011, (6): 595-599.

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