Pierce生物素化蛋白互作Pull-Down试剂盒
捕获纯化与生物素诱饵蛋白互作的蛋白
Pierce生物素（酰化）蛋白互作Pull-Down试剂盒包含使用生物素标记蛋白捕获和纯化与与其互作蛋白的必要成分。
实验者须提供生物素化蛋白作为“诱饵”（见相关产品，生物素化蛋白试剂盒）和表达互作靶标推测蛋白 （“猎物”）的细胞。Pull-Down试剂盒提供剩余所有用品：细胞裂解缓冲液，微型离心机离心柱，链亲和素琼脂糖树脂，优化的结合、洗脱缓冲液及详细的操作步骤。该试剂盒可使初学者掌握实验方法，而对于有经验的研究者更方便使用。操作步骤简便易学（图1）。
图1. Thermo Scientific生物素化蛋白相互作用Pull-Down 试剂盒操作步骤概要.
"Pull-down"除了其抗体功能被一些其他亲和体系所取代外，是一种类似免疫沉淀法（IP）的小规模亲和纯化技术。 在这里，亲和体系是已知且特异的生物素-链亲和素的相互作用。生物素化蛋白作为“诱饵”捕获推测的连接配体（即“猎物”）。在一个典型的pull-down实验中，被固定的诱饵蛋白在细胞裂解液中孵育。经过指定步骤的漂洗后，“反应物”被选择性洗脱以进行凝胶
分析或Western印迹。因为生物素-链亲素和的互作连接亲和度较高，一般情况下猎物蛋白被洗脱掉，而生物素化诱饵蛋白则仍保持固定在链亲和素琼脂糖树脂上，不被洗脱。
图1：
图2. 生物素化的胰凝乳蛋白酶(baCT) 经过pull-downreactor 翻译从哺乳动物细胞裂解液中捕获到的反应物牛胰胰蛋白酶抑制剂（BPTI）。
图像是用过Pull-Down试剂盒后的洗脱液和对照的Western印迹。baCT“诱饵”固定连接在链亲和素琼脂糖树脂上。BPTI“猎物”蛋白表达在哺乳动物细胞裂解液中。在对BPTI进行洗脱前，baCT“诱饵”蛋白仍连接在树脂上。经过4-20% Tris-Glycine SDS-PAGE。转至硝化纤维膜后，
样本被baCT诱饵蛋白探测到，再用Streptavidin-HRP (Product # 21124)探测，加入SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate (Product # 34075)，将印迹暴露在CL-XPosure X-ray Film (Product # 34080)下。
Lane 1: MW Markers                                         图2
Lane 2: blank
Lane 3:猎物蛋白标准（纯化的BPTI蛋白）；较低的条带是BPTI（牛胰胰蛋白酶抑制剂）的活性单体。
Prey protein standard (pure BPTI protein); the lower band is the active monomer of BPTI.
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Lane 5: 无诱饵阴性对照；pull-down中经过处理的含BPTI的裂解液样本，但不用任何生物素标记的对照诱饵蛋白。
No-bait negative control; BPTI-containing lysate sample processed in pull-down, but without using any biotinylated aCT bait protein.
Lane 6: 阴性对照裂解液（从不表达BPTI猎物蛋白的细胞中提取）；检测到的较上的条带是由哺乳动物细胞产出的未知的交互反应蛋白。
Negative control lysate (from cells not expressing the BPTI prey protein); detected upper band is an unknown cross-reacting protein produced by the mammalian cells.
Lane 7:阳性对照: 用Tris缓冲液稀释后再经过pull-down步骤处理过的BPTI。较低的条带是BPTI；较高的条带是未知的cross-reactor （见泳道6）
Positive control: BPTI diluted in Tris buffer and processed through the pull-down procedure. Lower band is BPTI; upper band is unknown cross-reactor (see Lane 6).
Lanes 8-12: 经过不同数量的醋酸盐缓冲液洗涤的洗脱样本（自8泳道8到泳道12逐渐从数量5减至数量1）。
Eluted samples following different numbers of acetate buffer washes (decreasing from 5 washes in lane 8 to 1 wash in lane 12).
应用：
●使用固相化的生物素标记诱饵蛋白从细胞裂解液中捕获“猎物”蛋白，发现新的蛋白质-蛋白质相互作用
●捕获细胞裂解液中的猎物蛋白或捕获纯化的猎物蛋白，以确定推测的相互作用
●确定两种纯化蛋白在各种缓冲液环境中的相互作用（连接）的能力
●从体外转录/翻译裂解物中获得蛋白质-蛋白质相互作用信息
强调：
●提供了全面、低价、使用方便的发现蛋白与蛋白互作的方法
●使用一般实验室的普通仪器和试剂（如微量离心机、迷你胶，蛋白染）
●适合单一或复合-单一的要求
●Flexible pull-down format uses spin cups for easy and efficient manipulation of streptavidin agarose beads
Pull-down技术：利用生物素化试剂盒将纯化的Cry1A毒素生物素化，并固定在链亲和素琼脂糖树脂上形成诱饵蛋白。Cry1A毒素诱饵蛋白与二化螟中肠BBMV细胞裂解液共孵育，来捕获和沉降与Cry1A毒素相互作用较强的结合蛋白，然后用低PH缓冲液洗脱结合蛋白并通过离心进行收集。
交联/标记转移技术：利用Sulfo-SBED生物素标记转移试剂盒标记纯化的Cry1A毒素，氨基基团被修饰（修饰部分含有生物素标签及叠氮苯）的Cry1A毒素成为诱饵蛋白。将Cry1A毒素诱饵蛋白与二化螟中肠BBMV细胞裂解液在黑暗中进行孵育，通过紫外光照射激活叠氮苯，从而将Cry1A毒素与结合蛋白或是相互接近的蛋白共价偶联在一起形成复合物，并利用还原反应实现生物素标签的转移，捕获纯化对于与Cry1A毒素相互作用较弱或是瞬时结合的结合蛋白。
将Cry1A毒素生物素化后固定在链亲和素琼脂糖树脂上作为诱饵，加入BBMV细胞裂解液来捕获BBMV中与毒素结合的猎物蛋白，最后将整个体系用特定溶液进行洗脱，洗脱下来的便是结合蛋白液。
利用特定的有机试剂，这种有机试剂同时含有二硫键、生物素和叠氮苯，它可以先利用二硫键与Cry1A毒素连接作为诱饵，再利用叠氮苯与毒素的结合蛋白或是离毒素距离较近的蛋白共价偶联，接着利用还原反应也就是二硫键的断裂，将生物素标签转移至猎物蛋白上，从而得到所需要的蛋白。

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