第45卷第10期
2019年10月
北京工业大学学报
JOURNAL OF BEIJING UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
Vol.45No.10
Oct.2019
游离亚硝酸对高效硝化菌的抑制影响
杨　宏，张　帆，王少伦，王佳伟
(北京工业大学北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京　100124)
摘　要：为了考察游离亚硝酸(free nitrous acid,FNA)对高效硝化菌(氨氧化菌(ammonia⁃oxidizing bacteria,AOB)和亚硝酸盐氧化菌(nitrite⁃oxidizing bacteria,NOB)活性的抑制影响.采用连续流反应器，通过逐步提高氨氮质量浓度的方式富集培养高效硝化菌，使得硝化速率高达89mg /(L ㊃h)，通过对污泥富集培
养前后细菌落组成的高通量分析表明,Nitrosomonas (31.02%)比原污泥提高了72.13倍，而Nitrospira (4.36%)提高了2.03倍.用富集培养后的污泥考察不同FNA 质量浓度对AOB 和NOB 活性的影响，并通过探究得出的有效FNA 质量浓度作用于不同硝化速率的污泥，考察在实现高纯度的高效AOB 菌培养过程中,FNA 值域的控制.结果表明,AOB 和NOB 的活性均受到FNA 的影响，当FNA 的质量浓度为0.5和0.6mg /L 时,AOB 和NOB 均保持较高活性.当FNA 的质量浓度为0.7mg /L 时，不仅能使NOB 活性逐渐降低到0，而且能使AOB 活性保持在56%以上.当FNA 的质量浓度为0.9mg /L 时,AOB 活性受到严重的抑制.因此，在实现高纯度的高效AOB 菌培养的过程中,0.7mg /L 是FNA 最适宜的质量浓度，并且对15~89mg /(L ㊃h)的硝化速率的污泥仍然有效，但随着硝化速率的提高,FNA 的质量浓度也需要相应提高以抑制NOB 活性同时保留AOB 活性.
关键词：游离亚硝酸；高效硝化菌；硝化速率；抑制；活性；高通量测序中图分类号:U 461;TP 308文献标志码:A
文章编号:0254-0037(2019)10-1017-08
doi :10.11936/bjutxb2018060019
收稿日期:2018⁃06⁃19
基金项目：中央引导地方科技发展专项资助项目(Z161100004516015)
作者简介：杨　宏(1963 )，男，教授，主要从事水环境恢复和水处理微生物技术方面的研究,E⁃mail:yhong@bjut.edu
Effect of Free Nitrous Acid Inhibition on High⁃efficiency
Nitrifying Bacteria
YANG Hong,ZHANG Fan,WANG Shaolun,WANG Jiawei
(Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environmental Recovery Engineering,
Beijing University of Technology,Beijing 100124,China)
Abstract :To investigate the effect of free nitrous acid (FNA)inhibition on the activity of high⁃efficiency nitrifying bacteria (ammonia⁃oxidizing bacteria (AOB )and nitrite⁃oxidizing bacteria (NOB )),a continuous⁃flow reactor was conducted at ammonia concentration gradients (50mg /L →80mg /L →100mg /L →150mg /L →200mg /L →250mg /L →300mg /L →350mg /L →400mg /L →450mg /L),resulting in a high nitrification rate of 89mg /(L㊃h ).High⁃throughput analysis showed that Nitrosomonas (31.02%)increased by 72.13times compared with the raw sludge.At the same time,Nitrospira (4.36%)increased by 2.03times.The effects of different FNA concentrations on AOB and
NOB activity were investigated by using the sludge.Subsequently,the effective FNA concentration obtained was applied for sludge with different nitrification rates.Results show that FNA inhibition can dramatically inhibit AOB and NOB activity.When the FNA concentration maintains at 0.5or 0.6mg /L,high activity
happens in AOB and NOB.The NOB activity is gradually reduced to 0%and AOB activity still maintains
北　京　工　业　大　学　学　报2019年above56%at an FNA concentration of0.7mg/L.The AOB activity is severely inhibited at an FNA level of0.9mg/L.Therefore,the FNA concentration of0.7mg/L can significantly inhibit NOB activity when the nitrification rates are between15and89mg/(L㊃h).However,FNA values should be increased to inhibit NOB activity and retain AOB activity as the nitrification rate increases.
Key words:free nitrous acid;efficient nitrifying bacteria;nitration rate;inhibition;activity;high⁃throughput sequencing
  短程硝化脱氮因具有减少能耗和节省碳源的优点而备受国内外学者的关注，其关键在于控制硝化过程稳定长效于亚硝化阶段，以亚硝酸盐氮的高积累为标志，从而阻断亚硝酸盐氮向硝酸盐氮的转化[1]，从生物学角度上说，即氨氧化细菌(ammonia⁃oxidizing bacteria,AOB)成为活性污泥系统中的功能菌，亚硝
酸盐氧化菌(nitrite⁃oxidizing bacteria,NOB)逐渐淘汰.
在污水厂实际运行过程中，短程硝化系统一般用于处理高氨氮废水，较少用于处理城市生活污水[2]，高氨氮系统容易实现短程硝化，系统通过高pH和低溶解氧(DO)实现短程硝化[3-4]，但高pH的调控使得污水厂运行成本高，而低DO的运行使得短程硝化处理效率低，因此若能驯化出高纯度的高效AOB菌(即AOB菌成为系统的第一大类优势菌,NOB菌完全从系统中淘汰)，将此菌投放污水厂中，不仅能实现城市污水短程硝化启动与稳定，而且能大幅度提升氨氮处理效率，降低运行成本，但高纯度的高效AOB菌的培养仍然是一个亟待解决的问题，因此培养此类功能菌成为研究的热点.
已有研究报道，游离亚硝酸(free nitrous acid, FNA)因其作用于微生物代谢酶进而抑制细菌活性，是实现NOB完全淘洗㊁高纯度的高效AOB菌培养的有力手段[5⁃9].在现有关于FNA抑制硝化菌的研究中，大多针对低硝化速率的活性污泥，而针对高效硝化污泥中AOB和NOB的FNA抑制影响没有得到太多深入的研究.
本研究以筛选和富集 纯”的高效AOB菌，实现NOB的完全淘汰为目标，采用连续流培养高效硝化菌，以富含AOB和NOB的高效硝化污泥为研究对象，采用批次试验研究FNA质量浓度对AOB 和NOB的抑制影响，以期为高纯度的高效AOB菌的获得提供理论支持；另外，采用高通量测序技术对比分析污水厂原污泥和培养后高效硝化菌中AOB和NOB的比例.1　材料与方法
1.1　高效硝化菌的富集培养
试验采用北京市高碑店污水处理厂回流污泥，并以此为菌源，采用连续流培养装置(如图1所示)进行高效硝化菌筛选和富集，反应器有效容积为
100L.试验采用模拟氨氮废水，主要成分有:NH4Cl (投加量取决于NH+4⁃N质量浓度),Na2CO3(2000 mg/L),KH2PO4和K2HPO4混合液(投加量取决于NH+4⁃N质量浓度，其中n(N)∶n(P)为5∶1),FeSO4㊃7H2O(30mg/L),MgSO4㊃7H2O(30mg/L),CaCl2(15 mg/L)，微量元素为1mL/L，其中ZnSO4㊃7H2O(0.5 g/L),MnCl2㊃4H2O(0.5g/L),CoCl2㊃6H2O(0.4g/ L),CuSO4㊃5H2O(0.4g/L),NiCl2㊃6H2O(0.2g/L)和Na2MoO4㊃2H2O(0.05g/L).
图1　高效硝化菌富集培养试验装置示意
Fig.1　Schematic diagram of efficient nitrification
bacteria enrichment device
培养过程中利用PLC控制温度在(25±0.1)℃,DO质量浓度为1.0~1.5mg/L,pH为7.0，水力停留时间(HRT)稳定控制在5h.利用梯度提高进水NH+4⁃N质量浓度的方式培养高效硝化菌，即当前一个进水NH+4⁃N质量浓度条件下的出水NH+4⁃N为零时，立刻提高到下一个进水NH+4⁃N质量浓度，经过25d的富集培养，
当反应体系中硝化
8101亚成reactor
　第10期杨　宏，等：游离亚硝酸对高效硝化菌的抑制影响速率达到89mg /(L ㊃h)，即为高效硝化菌[10].NH +4⁃N 质量浓度梯度为:50mg /L →80mg /L →100mg /L
→150mg /L →200mg /L →250mg /L →300mg /L →350mg /L →400mg /L →450mg /L.取若干份污泥进行下一步FNA 批次试验.
1.2　考察FNA 对高效硝化菌的抑制影响
此阶段试验主要包括2个部分，首先是不同FNA 质量浓度对高效硝化菌的抑制影响，确定有效的抑制阈值；接着以有效阈值作用于不同硝化效率的污泥，确定在实现NOB 完全淘汰的过程中,FNA 值域的控制.这两部分试验分别在如图2所示的反应器中进行，其有效容积为3.5L，采用穿孔管曝气，气体流量计调节曝气量控制DO 质量浓度为1.0~
1.5mg /L；温度传感器在线检测反应器内水温变化，控制温度为(25±0.1)℃；搅拌转速为200r /
min.图2　FNA 批次抑制试验装置示意
Fig.2　Schematic diagram of FNA inhibition batch device
不同FNA 质量浓度对高效硝化菌的抑制试验采用序批式运行，反应周期为3h.每个序批试验采用2种投药方式.其一是模拟连续流的进水方式，基于高效硝化种泥的硝化速率是89mg /(L ㊃h)，因此，在250mL 的氯化铵原液储备瓶里贮存267mg /L(89mg /(L ㊃h)硝化速率的3倍投药量)的氯化铵溶液，通过蠕动泵控制其流量为83.3mL /h，模拟连续流的进水方式，在3h 内连续不断地滴加氯化铵溶液于反应器内，即随着氨氮氧化的进行连续不断地补充氨氮；同时,pH 的控制也通过模拟连续流的进水方式，通过蠕动泵泵入碳酸钠溶液于反应器中，使得反应体系内的pH 稳定在7.0；其二是一次性投药方式，抑制试验开始前，通过取样口投加一定量的亚硝酸钠，使得混合液的亚硝态氮质量浓度和FNA 质量浓度如表1所示.试验从0min 开始，每隔30min 取样1次，并测定NH +4⁃N㊁NO -2⁃N㊁NO -3⁃N 质量浓度.AOB 和NOB 的活性采用NH +4⁃N 氧化速率和NO -3⁃N 生成
速率表征，计算混合液中每30min 的NH +4⁃N 质量浓度降低速率和NO -3⁃N 质量浓度增加速率，用FNA 质量浓度为0mg /L 的反应器中AOB 和NOB 的活性作为参比，计算其他FNA 质量浓度下AOB 的底物降解速率和NOB 的产物生成速率占参比数值的百分比，表示AOB 和NOB 的活性变化.
表1　游离亚硝酸批次试验条件
Table 1　Experimental conditions applied in FNA
batch tests
批次ρ(NO -2⁃N)/(mg ㊃L -1)
ρ(FNA)/(mg ㊃L -1)
试验100试验2736.90.5试验3865.70.6试验41001.60.7试验51398.5
0.9
  注:pH 均为7.0.
  通过上一部分试验确定出有效的FNA 抑制阈值，以有效的FNA 阈值作用于不同硝化速率的污泥的试验也采用序批式运行，反应周期为3h.此部分的试验污泥在硝化速率为89mg /(L ㊃h)污泥的基础
上进行浓缩或稀释，使得硝化速率分别为15㊁44㊁
133㊁178mg /(L ㊃h).此部分的2种投药方式和上一部分试验的2种投药方式相同，但氯化铵溶液的投加量根据硝化速率的改变而改变，分别为45㊁132㊁
399㊁534mg /L(均为硝化速率3倍的投药量)，亚硝酸钠溶液的投加量与上一部分试验确定的有效FNA 阈值的投加量相同.试验从0min 开始，每隔30min 取样1次，并测定NH +4⁃N㊁NO -2⁃N㊁NO -3⁃N 质量浓度.在不同的硝化速率的基础上，增加FNA 为0mg /L 的空白对照组，同样以NH +4⁃N 氧化速率和
NO -3⁃N 生成速率分别表征AOB 和NOB 的活性，计算混合液中每30min 的NH +4⁃N 质量浓度降低速率和NO -3⁃N 质量浓度增加速率，用FNA 质量浓度为0mg /L 的反应器中AOB 和NOB 的活性作为参比，计算不同硝化速率条件下AOB 的底物降解速率和NOB 的产物生成速率占参比数值的百分比，表示AOB 和NOB 的活性变化.
1.3　分析项目及方法1.3.1　常规分析方法NH +4⁃N㊁NO -2⁃N㊁NO -3⁃N 均采用标准方法进行
测定[11].NH +4⁃N 采用纳式试剂分光光度法(HJ
9
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北　京　工　业　大　学　学　报2019年535 2009);NO-2⁃N采用N⁃(1⁃萘基)-乙二胺紫外
分光光度法;NO-3⁃N采用麝香草酚紫外分光光度
法.批次试验的游离亚硝酸(FNA)一般采用
FNA=4614ρ(NO-2⁃N)
10pH(exp-2300
273+)T (1)
进行计算[12].式中:ρ(NO-2⁃N)表示批次试验反应器内测得的NO-2⁃N质量浓度,mg/L;T为反应体系中的温度,℃.FNA是与NO-2⁃N质量浓度㊁温度㊁pH值三者相关的函数，且与NO-2⁃N质量浓度呈正相关，与pH㊁温度呈负相关.本试验采用恒定温度((25±0.1)℃)，恒定pH(7.0)，不同NO-2⁃N质量浓度来获得不同FNA质量浓度.
批次试验中AOB活性和NOB活性按
AOB活性=μ(NH+4⁃N t)
μ(NH+4⁃N0)×100%(2)
NOB活性=μ(NO-3⁃N t)
μ(NO-3⁃N0)×100%(3)进行计算.式中:μ(NH+4⁃N t)表示每30min的NH+4⁃N氧化速率,mg/(L㊃h);μ(NH+4⁃N0)表示FNA 为0时的NH+4⁃N氧化速率,mg/(L㊃h);μ(NO-3⁃N t)表示每30min的NO-3⁃N生成速率,mg/(L㊃h);μ(NO-3⁃N0)表示FNA为0时NO-3⁃N生成速率,mg/ (L㊃h).
1.3.2　高通量测序分析方法
取污水厂原污泥和培养后的活性污泥进行高通量测序，分别标记为S0和S1.首先，提取样本中的DNA进行16S rRNA的V3⁃V4区间的PCR扩增[13].得到的PCR扩增产物通过电泳检测产生较长序列.利用HiSeq2500PE250高通量测序平台对序列进行评估和测量，然后由序列获得的reads按照一定的阈值进行分类，得到多个序列聚类操作分类单元(OTUs)，根据OTUs进行物种丰度和多样性的分析.
2　结果与讨论
2.1　高效硝化菌的富集培养及高通量测序分析富集培养过程中，采用NH+4⁃N作为唯一氮源，采用梯度提高进水NH+4⁃N的方式，进行AOB和NOB的高效富集培养.反应过程中温度控制在(25±0.1)℃,DO质量浓度为1.0~1.5mg/L,pH 为7.0,HRT为5h，均为适宜AOB和NOB共同生长的条件[14⁃16].图3显示了培养过程中反应器的运行工况，尽管整个周期内进水NH+4⁃N质量浓度不断提升，到后期高达450mg/L，但出水NO-2⁃N一直保持在0.58mg/L以下,NO-3⁃N积累率一直稳定在99%以上.这显示NH+4⁃N在AOB和NOB的共同作用下，几乎全部转化为NO-3⁃N，反应体系内的AOB和NOB都具有良好的活性，硝化速率也从最初的9.71mg/(L㊃h)增长至25d后的89mg/(L㊃h)，实现了高效硝化菌的富集培养.
图3　连续流反应器运行工况
Fig.3　Nitrification performance of continuous⁃flow
reactor
分析高通量测序结果，原污泥样本S0和培养后样本S1的文库覆盖率均为0.93(数据未显示)，表明测序深度已经基本覆盖到样本中的所有物种.图4显示了2个样本在属级水平上的落结构分布.原污泥样本菌属分配均匀，均为污水处理中常见的菌属[17⁃19].可以发现，原污泥样本中属于污水处理系统中常见的NOB菌属Nitrospira[20]不是系统中的优势菌属，仅占2.14%，而属于污水处理系统中常见的AOB菌属Nitrosomonas[21]占0.43%，经过定向筛选培养的污泥,Nitrosomonas成为系统内的第一大类优势菌属，比例为31.02%,Nitrospira成为系统中的第四大类优势菌属，比例为4.36%.AOB的菌属含量比原污泥提高了72.13倍，而NOB的菌属含量仅提高了2.03倍，说明NOB比AOB生长更为缓慢，这与其他研究者研究结果类似[22⁃23].AOB和NOB比例的增长从分子生物学角度印证了系统内的硝化速率在短时间内的高效增长，即从最初的9.71mg/(L㊃h)增长到89mg/(L㊃h)，同时也说明本试验的培养方式适合于AOB和NOB的共同生长，并且，定向筛选后的硝化污泥的硝化效果比原始污泥更加显著，使得后续FNA的批次抑制试验的结果更加可靠和稳定.
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　第10期杨　宏，等:
游离亚硝酸对高效硝化菌的抑制影响图4　属级水平S0和S1样本落结构分布图
Fig.4　Distribution of S0and S1microbial community at the genus level
2.2　不同游离亚硝酸(FNA )质量浓度对高效硝化
菌的抑制影响
为确定有效的FNA 抑制阈值，设定FNA 值分
别为0.5㊁0.6㊁0.7㊁0.9mg /L [24⁃26].通过模拟连续流的进水方式连续流加NH +4⁃N，保证NH +4⁃N →NO -2⁃N →NO -3⁃N 硝化过程的完成，以每30min 的NH +4⁃N 氧化速率和NO -3⁃N 生成速率与对照试验(FNA =0)的每30min 的NH +4⁃N 氧化速率和NO -3⁃N 生成速率相除，以百分比的形式表征AOB 和NOB 的活性.图5显示了3h 内AOB 和NOB 活性的变化情况，当FNA 为0.5mg /L 时,FNA 对AOB 的抑制影响不大,AOB 活性仍然维持在90%以上，对NOB 有轻微的抑制,NOB 活性从30min 的88%逐渐下降到76%；当FNA 为0.6mg /L 时,AOB 活性略有降低，从30min 的89%逐渐降低到78%,NOB 活性却大幅度减少,30min 时,NOB 活性仅为62%，随着反应的进行,NOB 活性降低到37%；当FNA 为
0.7mg /L 时,AOB 活性从78%下降到56%,NOB 活性在30min 时的活性为41%，到150min 180min 时,NOB 活性降到0%；当FNA 为0.9mg /L,AOB 活性也大幅度降低，介于56%~27%,NOB 从一开始就丧失活性，直到150min 才开始恢复活性，到反应末期只恢复了1%的活性.
试验结果表明，想要完全抑制NOB 的活性，同时保留AOB 的高活性，选择0.7mg /L 的FNA 质量浓度是最适宜的.此时,AOB 活性虽然呈现下降趋势，但仍然保持着56%以上的活性，且在150min 180min 的反应后期,AOB 活性下降速率减慢,AOB 对FNA 的抑制产生了适应性，这与Yang 等[27]得出的结论一致，因此，在高纯度的高效AOB 菌的培养过程中,AOB 在此FNA 质量浓度的抑制下，能够占据优势地位保持良好的活性,NOB
活性在反应末
图5　不同FNA 质量浓度对AOB 和NOB 的活性影响
Fig.5　Effects of different FNA levels on AOB
and NOB activity
期却降到0，说明0.7mg /L 的FNA 质量浓度能够有效抑制NOB 的活性，同时又保留AOB 的高活性.相较于0.5和0.6mg /L 的FNA 质量浓度抑制下,AOB 和NOB 均保持着相对较高的活性，且在反末期均有活性下降㊁速率减慢的趋势，因此,0.5和0.6mg /L 的FNA 质量浓度并不适用于NOB 菌完全淘洗的抑制过程.而在0.9mg /L 的FNA 质量浓度抑制下,AOB 活性受到严重的抑制，到后期只剩余
27%的活性，虽然NOB 在前150min 内活性为0，但1
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