ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２１．０２．１４·研究生园地·
改良麦康凯平板筛查肠道定植耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的性能评价
康佳１，赵志军２，３，李刚２，茆永娟１，杨红１，周云花１，潘亚菲１，贾伟２，３（１．宁夏医科大学临床医学院，银川７５０００４；２．宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川７５０００４；３．宁夏临床病原微生物重点实验室，银川７５０００４）
摘要：目的　建立一种运用改良麦康凯平板快速筛查肠道定植耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（ＣＲＥ）的方法，并进行性能评价。方法　分别制备含有终浓度为４μｇ／ｍＬ亚胺培南、４μｇ／ｍＬ美罗培南、２μｇ／ｍＬ厄他培南的改良麦康凯平板。选用临床连续分离４５株ＣＲＥ及３０株非ＣＲＥ菌株，检测改良麦康凯平板的敏感性及特异性，采用其中２０株ＣＲＥ菌株对改良平板的最低检测限进行评估。ＰＣＲ方法检测ＣＲＥ菌株耐药基因（ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＮＤＭ、ＫＰＣ、ＯＸＡ ４８、ＶＩＭ、ＩＭＰ）。收集１４２例粪便样本评价改良平板的筛查性能，并与肉汤增菌法及ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基进行比较。结果　４５株ＣＲＥ菌株中ＴＥＭ、ＳＨＶ检出率分别为６２．２２％（２８／４５）和２４．４４％（１１／４５），ＮＤＭ、ＫＰＣ、ＯＸＡ ４８的检出率分别为６２．２２％（２８／４５）、１５．５６％（７／４５）和１３．３３％（６／４５），未检出ＶＩＭ和ＩＭＰ。４５株ＣＲＥ菌株在厄他培南改良平板上均生长，亚胺培南改良平板生长４４株，美罗培南改良平板生长４３株，敏感性分别为
１００％（４５／４５）、９７．７８％（４４／４５）和９５．５６％（４３／４５）。３０株非ＣＲＥ菌株在亚胺培南与美罗培南改良平板上均未生长，在厄他培南改良平板上生长２株，特异性分别为１００％（３０／３０）、１００％（３０／３０）和９３．３３％（２８／３０）。２０株ＣＲＥ中，接种菌液浓度为１０５～１０８ＣＦＵ／ｍＬ时，亚胺培南、美罗培南和厄他培南改良平板的检出率分别为７０％（１４／２０）、６５％（１３／２０）和
１００％（２０／２０）；接种浓度为１０５ＣＦＵ／ｍＬ以下时亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良平板的检出率分别为１０％（２／２０）、１０％（２／２０）和９５％（１９／２０）。亚胺培南、美罗培南改良麦康凯平板最低检测限大多分布在１０５～１０８ＣＦＵ／ｍＬ接种水平，而厄他培南改良麦
康凯平板最低检测限集中分布于１０２～１０３ＣＦＵ／ｍＬ。１４２份粪便样本中，亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良麦康凯平板分别筛查出３株、２株、４株ＣＲＥ，均未检出非ＣＲＥ菌株；肉汤增菌法检出５株ＣＲＥ及２株非ＣＲＥ；ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基检出５株ＣＲＥ及１株非ＣＲＥ。３种改良平板与肉汤增菌法及ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基筛查结果间差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。与亚胺培南和美罗培南相比，厄他培南平板筛查结果与肉汤增菌法、ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基一致性更好，
Ｋａｐｐａ值分别为０．７１７和０．８８５。结论　改良麦康凯平板筛查肠道ＣＲＥ菌株敏感性和特异性高，且操作简便，价格低廉，对操作人员技术要求低。厄他培南改良麦康凯平板具有更低的检测限，且与肉汤增菌法及ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基筛查结果
有更好的一致性，更适合推广使用。
关键词：肠道定植；耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌；改良麦康凯培养基；性能评价
中图分类号：Ｒ４４６．５    文献标志码：Ａ
ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｍｏｄｉｆｉｅｄＭａｃＣｏｎｋｅｙｐｌａｔｅｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＥｎｔｅｒｏｂａｃ ｔｅｒｉａｃｅａｅ
ＫＡＮＧＪｉａ１，ＺＨＡＯＺｈｉｊｕｎ２，３，ＬＩＧａｎｇ２，ＭＡＯＹｏｎｇｊｕａｎ１，ＹＡＮＧＨｏｎｇ１，ＺＨＯＵＹｕｎｈｕａ１，ＰＡＮＹａｆｅｉ１，ＪＩＡＷｅｉ２，３（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｌｉｎｉ ｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＮｉｎｇｘｉａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ７５０００４，Ｎｉｎｇｘｉａ；２．ＭｅｄｉｃａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒ，ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮｉｎｇｘｉａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ７５０００４，Ｎｉｎｇｘｉａ；３．ＮｉｎｇｘｉａＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ７５０００４，Ｎｉｎｇｘｉａ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ　Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｔｏｒａｐｉｄｌｙｓｃｒｅｅｎｔｈｅｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（ＣＲＥ）ｂａｃｔｅｒｉａｃｏｌｏｎｉｚｅｄｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎｅｂｙｕｓｉｎｇｍｏｄｉｆｉｅｄＭａｃＣｏｎｋｅｙｐｌａｔｅ，ａｎｄｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄＭａｃＣｏｎｋｅｙｐｌａｔｅｓｗｉｔｈｆｉｎａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ４μｇ／ｍＬｉｍｉｐｅｎｅｍ，４μｇ／ｍＬｍｅｒｏｐｅｎｅｍａｎｄ２μｇ／ｍＬｅｒｔａｐｅｎｅｍｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ４５ｓｔｒａｉｎｓｏｆＣＲＥａｎｄ３０ｓｔｒａｉｎｓｏｆｎｏｎ ＣＲＥｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄＭａｃＣｏｎｋｅｙｐｌａｔｅ．ＴｗｅｎｔｙｓｔａｉｎｓｏｆＣＲＥａｍｏｎｇｔｈｅａｂｏｖｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｍｉｎｉｍｕｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄｐｌａｔｅ．ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄ
ｅｔｅｃｔｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓｏｆＣＲＥｓｔｒａｉｎｓ，ｉ．ｅ．，ＴＥＭ，ＳＨＶ，ＮＤＭ，ＫＰＣ，ＯＸＡ ４８，ＶＩＭａｎｄＩＭＰ．Ａｔｏｔａｌｏｆ１４２ｓｔｏｏｌｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄｐｌａｔｅａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅ
基金项目：国家自然科学基金项目地区科学基金（８１９６０３８６）；宁夏回族自治区重点研发计划重大（重点）项目（２０１８ＢＦＧ０２００８）。
    作者简介：康佳，１９９４年生，女，硕士研究生，主要从事细菌耐药方面的研究。
    通信作者：贾伟，主任技师，硕士，Ｅ ｍａｉｌ：ｊｉａｗｅｉ６３６５＠１２６．ｃｏｍ。
ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂｒｏｔｈ ｅｎｈａｎｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｍｅｔｈｏｄａｎｄＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｍｅｄｉｕｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｍｏｎｇｔｈｅ４５ｓｔｒａｉｎｓ，ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｒａｔｅｓｏｆＴＥＭａｎｄＳＨＶｗｅｒｅ６２．２２％（２８／４５）ａｎｄ２４．４４％（１１／４５）．ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆＮＤＭ，ＫＰＣａｎｄＯＸＡ ４８ｗｅｒｅ６２．２２％（２８／４５），１５．５６％（７／４５）ａｎｄ１３．３３％（６／４５）ｒｅｓｐｅ
ｃｔｉｖｅｌｙ．ＮｏＶＩＭａｎｄＩＭＰｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ．Ａｌｌｔｈｅ４５ＣＲＥｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｇｒｏｗｎｏｎ
ｍｏｄｉｆｉｅｄｅｒｔａｐｅｎｅｍｐｌａｔｅｓ，４４ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｇｒｏｗｎｏｎｍｏｄｉｆｉｅｄｉｍｉｐｅｎｅｍｐｌａｔｅｓ，ａｎｄ４３ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｇｒｏｗｎｏｎｍｏｄｉｆｉｅｄｍｅｒｏｐｅｎｅｍｐｌａｔｅｓ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅ１００％（４５／４５），９７．７８％（４４／４５）ａｎｄ９５．５６％（４３／４５）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ３０ｎｏｎ ＣＲＥｓｔｒａｉｎｓｄｉｄｎｏｔ
ｇｒｏｗｏｎｍｏｄｉｆｉｅｄｉｍｉｐｅｎｅｍａｎｄｍｅｒｏｐｅｎｅｍｐｌａｔｅｓ，ｂｕｔ２ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｇｒｏｗｎｏｎｍｏｄｉｆｉｅｄｅｒｔａｐｅｎｅｍｐｌａｔｅｓｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓｏｆ１００％（３０／３０），１００％（３０／３０）ａｎｄ９３．３３％（２８／３０）ｆｏｒｔｈｅ３ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｍｏｎｇｔｈｅ２０ＣＲＥｓｔｒａｉｎｓ，ｗｈｅｎｔｈｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ１０５ｔｏ１０８ＣＦＵ／ｍＬ，ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｍｏｄｉｆｉｅｄｐｌａｔｅｓｏｆｉｍｉｐｅｎｅｍ，ｍｅｒｏｐｅｎｅｍａｎｄｅｒｔａｐｅｎｅｍｗｅｒｅ７０％（１４／２０），６５％（１３／２０）ａｎｄ１００％（２０／２０）
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ｗｈｅｎｔｈｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｌｅｓｓｔｈａｎ１０５ＣＦＵ／ｍＬ，ｔｈｅｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｍｏｄｉｆｉｅｄｐｌａｔｅｓｏｆｉｍｉｐｅｎｅｍ，ｍｅｒｏｐｅｎｅｍａｎｄｅｒｔａｐｅｎｅｍｗｅｒｅ１０％（２／２０），１０％（２／２０）ａｎｄ９５％（１９／２０）ｒｅｓｐｅｃ ｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｍｉｎｉｍｕｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｓｏｆｍｏｄｉｆｉｅｄＭａｃＣｏｎｋｅｙｐｌａｔｅｓｏｆｉｍｉｐｅｎｅｍａｎｄｍｅｒｏｐｅｎｅｍｗｅｒｅｍｏｓｔｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄａｔｔｈｅｉｎｏｃｕｌａ ｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆ１０５ｔｏ１０８ＣＦＵ／ｍＬ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｍｉｎｉｍｕｍｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｓｏｆｍｏｄｉｆｉｅｄｅｒｔａｐｅｎｅｍＭａｃＣｏｎｋｅｙｐｌａｔｅｓｗｅｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄａｔｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ１０２ａｎｄ１０３ＣＦＵ／ｍＬ．Ａｍｏｎｇｔｈｅ１４２ｓｔｏｏｌｓａｍｐｌｅｓ，３，２ａｎｄ４ｓｔａｉｎｓｏｆＣＲＥｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｏｎｍｏｄｉｆｉｅｄｉｍｉｐｅｎ ｅｍ，ｍｅｒｏｐｅｎｅｍａｎｄｅｒｔａｐｅｎｅｍＭａｃＣｏｎｋｅｙｐｌａｔｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｎｏｎｏｎ ＣＲＥｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ．ＦｉｖｅＣＲＥａｎｄ２ｎｏｎ ＣＲＥｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｂｒｏｔｈ ｅｎｈａｎｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ５ＣＲＥｓｔｒａｉｎｓａｎｄ１ｎｏｎ ＣＲＥｓｔｒａｉｎｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙＣＨ
ＲＯＭａｇａｒＫＰＣｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｍｏｄｉｆｉｅｄｐｌａｔｅａｎｄｂｒｏｔｈ ｅｎｈａｎ ｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｍｅｔｈｏｄａｎｄＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｍｅｄｉｕｍ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｉｍｉｐｅｎｅｍａｎｄｍｅｒｏｐｅｎｅｍ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｒｔａｐｅｎｅｍｐｌａｔｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｗｅｒｅｍｏｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｂｒｏｔｈ ｅｎｈａｎｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｍｅｔｈｏｄａｎｄＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈＫａｐｐａｖａｌｕｅｓｏｆ０．７１７ａｎｄ０．８８５ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄＭａｃＣｏｎｋｅｙｐｌａｔｅｄｅｓｉｇｎｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｈｉｇｈｓｅｎｓｉ ｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｉｍｐｌｅｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｌｏｗｐｒｉｃｅａｎｄｌｏｗｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｏｐｅｒａｔｏｒｓ．ＡｍｏｎｇｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｄｍｏｄｉｆｉｅｄＭａｃＣｏｎ ｋｅｙｐｌａｔｅｓ，ｔｈｅｅｒｔａｐｅｎｅｍｐｌａｔｅｓｈｏｗｅｄｌｏｗｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔａｎｄｂｅｔｔｅｒｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙｗｉｔｈｔｈｅｂｒｏｔｈ ｅｎｈａｎｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｍｅｔｈｏｄａｎｄＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｍｅｄｉｕｍｆｏｒｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄｓｈｏｕｌｄｂｅｍｏｒｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｐｏｐｕｌａｒｉｚｅｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ；ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ；ｍｏｄｉｆｉｅｄＭａｃＣｏｎｋｅｙｔａｂｌｅｔ；ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
  人体肠道是致病菌的天然储存库，携带碳青霉烯酶编码基因菌株易导致耐药基因在肠道细菌之
间传递［１］，使耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（ｃａｒｂａｐ
ｅｎｅｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，ＣＲＥ）肠道定植越来越普遍。研究表明，ＣＲＥ定植会增加患者感染
ＣＲＥ的风险，造成患者死亡率升高［２］。因此，对于入院患者，尤其是重症患者进行肠道定植ＣＲＥ筛
查尤为重要。目前，国际上对ＣＲＥ的筛查方法尚无统一标准，主要有美国疾病控制与预防中心（ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＣＤＣ）推荐的肉汤增菌法、商品化显培养基、ＰＣＲ方法等，但以上方法仍存在操作繁琐、检测周期长、检测成本高等问题。因此，有必要建立一种敏感性和特异性高、操作简便且适合推广使用的肠道定植ＣＲＥ筛查方法。本实验通过在麦康凯培养基中分别加入３种不同碳青霉烯类药物制成改良平板，用ＣＲＥ菌株和非
ＣＲＥ菌株检测其敏感性、特异性和最低检测限；通过临床粪便样本验证平板筛查性能，并与肉汤增菌法及ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基进行对比评价。
１　材料与方法
１．１　菌株来源　收集２０１９年１—１２月宁夏医科大学总医院临床连续分离４５株ＣＲＥ菌株（包括肺炎克雷伯菌２１株、大肠埃希菌１２株、阴沟肠杆菌１０株、产酸克雷伯菌１株和弗劳地柠檬酸杆菌１株）和３０株非ＣＲＥ菌株（包括肺炎克雷伯菌１２株、大肠埃希菌１０株、阴沟肠杆菌８株），其中收集于２０１９年６—１２月的２０株ＣＲＥ（包括肺炎克雷伯菌
１０株、大肠埃希菌４株、阴沟肠杆菌６株）用于最低检测限评估。同时收集２０１９年１１—１２月重症监
护室患者非重复粪便样本１４２份。ＣＲＥ判定标准：依据美国ＣＤＣ发布的ＣＲＥ指南［３］，亚胺培南或美罗培南最低抑菌浓度（ｍｉｎｉｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａ ｔｉｏｎ，ＭＩＣ）≥４μｇ／ｍＬ和（或）厄他培南ＭＩＣ≥
２μｇ／ｍＬ（微量肉汤稀释法）。经测序证实产ＫＰＣ型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌临床分离菌为宁夏医
科大学总医院医学实验中心保存，大肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２购自北京百欧博伟生物技术公司。１．２　主要试剂与仪器　ＰｒｅｍｉｘＴａｑＴＭ（ＴａＫａＲａ
ＴａｑＴＭＶｅｒｓｉｏｎ２．０ｐｌｕｓｄｙｅ）、ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＴａＫａＲａ公司）；琼脂糖（西班牙ＢＩＯＷＥＳＴ公司）；
麦康凯琼脂培养基干粉、Ｍ Ｈ（Ｂ）培养基干粉（北京索莱宝公司）；亚胺培南药粉、美罗培南药粉、厄他培南药粉（＞９５％ＢＲ，大连美仑公司）；胰蛋白酶大豆肉汤（ＴＳＢ）培养基、１０μｇ美罗培南药敏纸片
（英国Ｏｘｏｉｄ公司）；
ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基（法国科玛嘉公司）；Ｍ Ｈ固体培养基（郑州安图生
物公司）；一次性培养皿（浙江拱东公司）；恒温培养箱（上海力申公司）；Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动细菌鉴定系统及配套ＡＳＴ ＧＮ０４药敏卡、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦＭＳ仪、麦氏比浊仪（法国生物梅里埃公司）；ＰＣＲ扩增
仪、电泳仪、凝胶成像仪（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司）
。
１．３　ＰＣＲ法检测耐药基因　煮沸法提取ＤＮＡ，采用ＰＣＲ法检测ＣＲＥ相关耐药基因（ＴＥＭ、ＳＨＶ、
ＮＤＭ、ＫＰＣ、ＯＸＡ ４８、ＶＩＭ、ＩＭＰ）
，引物设计参考文献［４］。反应体系５０μＬ：ＰｒｅｍｉｘＴａｑＴＭ
２５μＬ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，ＤＮＡ模板１μＬ，双蒸水２２μＬ。反应条件：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５～５７℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，３０个循环；７２℃５ｍｉｎ。引物序列及退火温度见表１。引物合成及ＰＣＲ产物测序均由上海生工生物工程公司完成，测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中原序列进行比对鉴定。
表１　耐药基因引物序列、
产物长度和退火温度耐药基因
引物序列（
５′→３′）退火温度（
℃）产物
长度（ｂｐ）ＳＨＶＦ：
ＡＴＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧ
５６８６１Ｒ：ＴＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡＴＣＴＥＭＦ：ＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣ５６８５８Ｒ：ＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＫＰＣＦ：ＡＴＧＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴ５６８９３Ｒ：ＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＴＧＣＣＣＮＤＭＦ：ＡＴＧＧＡＡＴＴＧＣＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＧＣ５６８１３Ｒ：ＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＧＶＩＭＦ：ＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＡＴＧＴ５５９２０Ｒ：ＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＣＣＡＡＣＧＡＩＭＰＦ：ＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＣ５５７４０Ｒ：ＴＴＡＧＴＴＧＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＧＯＸＡ ４８
Ｆ：ＧＣＧＴＧＧＴＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＣＡＣ５７
４３８
Ｒ：ＣＡＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧ
１．４　
改良麦康凯平板、ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养
平板的制备及结果判读　分别称取３．３ｇＣＨＲＯＭａ ｇａｒＫＰＣ显培养基干粉及５１．５ｇ麦康凯琼脂干粉，各溶解于１０００ｍＬ蒸馏水中，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。待培养基冷却至４５～５０℃时，向ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基中加入０．４ｇ增补剂（试剂自带），同时依据ＣＬＳＩＭ１００第３０版［５
］肠杆菌科关于各药物耐药的ＭＩＣ折点，向麦康凯培养基中分别加入３种碳青霉烯类药物（终浓度为亚胺培南４μｇ／ｍＬ、美罗培南４μｇ／ｍＬ、厄他培南
２μｇ／ｍＬ）
。轻轻摇动锥形瓶，混匀后立即倾注２５ｍＬ至９０ｍｍ平皿中，凝固后备用。标本接种于改良麦康凯平板３５℃培养１６～１８ｈ后菌落经
Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动细菌鉴定系统及配套ＡＳＴ ＧＮ０４药敏卡鉴定为肠杆菌科细菌且亚胺培南或美罗培南ＭＩＣ≥４μｇ／ｍＬ和（或）厄他培南ＭＩＣ≥２μｇ／ｍＬ则判定为ＣＲＥ［３］。标本接种ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基３５℃培养１６～１８ｈ后菌落呈暗粉红到红菌落为碳青霉烯类耐药大肠埃希菌，菌落呈深蓝则为碳青霉烯类耐药克雷伯菌属、肠杆菌属、枸橼酸杆菌。
１．５　肉汤增菌法　根据ＣＲＥ指南［３］，
制备１００μＬ粪便悬液（每毫升生理盐水约０．５ｇ粪便），将其加入含有一片１０μｇ美罗培南药敏纸片的５ｍＬＴＳＢ培养基中。置于３５℃培养１６～１８ｈ后吸取１００μＬ培养液移种至普通麦康凯平板上，过夜培养。挑取乳糖发酵的菌落用Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动微生物分析仪及配套ＡＳＴ ＧＮ０４药敏卡进行菌株鉴定和药物敏感性试验。
１．６　微量肉汤稀释法　根据药物的理化性质及使用说明将亚胺培南和美罗培南分别配制成终浓度
为２５６０μｇ／ｍＬ的药物储存液，
在９６孔板中连续倍比稀释后得到一系列１００μＬ药物梯度稀释液（药物浓度范围为０．１２５～２５６μｇ／ｍＬ）。将待测菌经Ｍ Ｈ琼脂平板３５℃过夜培养后配制成０．５麦氏浊度的菌悬液，稀释１００倍后取１００μＬ菌悬液分别接种于含１００μＬ药物的小孔中。阴性对照孔加入２００μＬ菌悬液，空白对照孔加入２００μＬＭ Ｈ肉汤培养基。将接种好的９６孔板置于３５℃恒温培养箱２４ｈ后观察细菌，将菌体生长量约８０％被抑制判为终点孔。质控菌株：大肠埃希菌ＡＴＣＣ
２５９２２，
结果解释参照ＣＬＳＩ文件［５］。１．７　敏感性与特异性检测　菌株经血平板复苏后，分别接种于３种不同抗菌药物的改良麦康凯平板，置于３５℃培养１６～１８ｈ，观察是否长出菌落。经测序证实
产ＫＰＣ型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌为阳性质控，大肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２为阴性质控。１．８　最低检测限的评估　选取２０株ＣＲＥ临床菌株经接种血平板复苏后，用生理盐水配置成０．５麦氏浊度单位菌悬液，并进行１０１
～１０６
倍比稀释，制成１０２
～１０８
ＣＦＵ／ｍＬ菌悬液，取不同浓度的菌悬液１０μＬ分别接种于３种不同抗菌药物的改良麦康凯平板，置３５℃培养１６～１８ｈ，观察是否长出菌落，所有菌株重复检测３次。
１．９　临床样本的性能验证　将１４２份粪便样本分别用肉汤增菌法、ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基以及改良麦康凯平板３种方法接种，置于３５℃培养１６～１８ｈ，观察是否生长菌落。将长出的菌落分离纯
化后用Ｖｉｔｅｋ２Ｃｏｍｐａｃｔ全自动微生物分析仪进行菌株鉴定和药物敏感性试验，并用ＭＡＬＤＩ ＴＯＦＭＳ及微量肉汤稀释法复核最终结果。药敏试验操作方法及结果解释参照ＣＬＳＩ标准［５］。
１．１０　统计学分析　用ＳＰＳＳ２６．０软件进行。计数资料用例数表示，方法间筛查结果的一致性采用Ｋａｐｐａ
一致性检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２　结果
２．１　ＰＣＲ结果　４５株ＣＲＥ中仅检出１种耐药基因１５株，检出２种耐药基因２５株，另外５株检出３
种耐药基因。ＴＥＭ、ＳＨＶ检出率分别为６２．２２％（２８／４５）和２４．４４％（１１／４５），ＮＤＭ、ＫＰＣ、ＯＸＡ ４８的检出率分别为６２．２２％（２８／４５）、１５．５６％（７／４５）和１３．３３％（６／４５），未检出ＩＭＰ及ＶＩＭ。见表２。
表２　４５株ＣＲＥ的耐药基因结果
菌名（ｎ）耐药基因菌株数肺炎克雷伯菌（２１）ＮＤＭ４
ＴＥＭ＋ＳＨＶ４
ＴＥＭ３
ＮＤＭ＋ＴＥＭ２
ＮＤＭ＋ＳＨＶ２
ＴＥＭ＋ＳＨＶ＋ＫＰＣ２
ＫＰＣ１
ＴＥＭ＋ＫＰＣ１
ＮＤＭ＋ＯＸＡ ４８１
ＮＤＭ＋ＳＨＶ＋ＯＸＡ ４８１大肠埃希菌（１２）ＴＥＭ４
ＴＥＭ＋ＮＤＭ４
ＮＤＭ１
ＴＥＭ＋ＮＤＭ＋ＯＸＡ ４８１
ＴＥＭ＋ＮＤＭ＋ＫＰＣ１
ＴＥＭ＋ＯＸＡ ４８１阴沟肠杆菌（１０）ＮＤＭ＋ＴＥＭ３
ＮＤＭ＋ＯＸＡ ４８２
ＮＤＭ＋ＫＰＣ２
ＮＤＭ＋ＳＨＶ１
ＮＤＭ１
ＳＨＶ１产酸克雷伯菌（１）ＴＥＭ＋ＮＤＭ１
弗劳地柠檬酸杆菌（１）ＴＥＭ＋ＮＤＭ１２．２　改良麦康凯平板检测ＣＲＥ的敏感性及特异性
　４５株ＣＲＥ中，亚胺培南改良麦康凯平板上有１株携带ｂｌａＴＥＭ大肠埃希菌未生长；美罗培南改良麦
康凯平板上有２株未生长，分别为携带ｂｌａＴＥＭ大肠埃希菌和ｂｌａＫＰＣ肺炎克雷伯菌；４５株ＣＲＥ均在厄他培南改良麦康凯平板上生长。３０株非ＣＲＥ菌株，除２株肺炎克雷伯菌在厄他培南改良麦康凯平板上生长外，其余菌株均不生长。亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良麦康凯平板分别检出４４株、４３株和４５株ＣＲＥ，敏感性分别为９７．７８％（４４／４５）、
９５．５６％（４３／４５）和１００％（４５／４５）；亚胺培南与美罗培南改良平板特异性均为１００％（３０／３０），厄他培南为９３．３３％（２８／３０）；美罗培南与亚胺培南改良平板阳性预测值一致，为１００％，厄他培南为９５．７４％；阴性预测值由高到低分别为厄他培南改良平板（１００％）、亚胺培南改良平板（９６．７７％）和美罗培南改良平板（９３．７５％）。
２．３　改良麦康凯平板最低检测限评估　２０株ＣＲＥ中，接种菌液浓度为１０８ＣＦＵ／ｍＬ时，亚胺培南、美
罗培南、厄他培南改良平板上分别有１４株、１３株、
２０株生长，检出率分别为７０％（１４／２０）、６５％（１３／２０）和１００％（２０／２０）；接种菌液浓度为１０７
ＣＦＵ／ｍＬ时，亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良平板上分别有１１株、１０株、２０株生长，检出率分别为
５５％（１１／２０）、５０％（１０／２０）和１００％（２０／２０）；接种菌液浓度为１０６ＣＦＵ／ｍＬ时，亚胺培南、美罗培南、
厄他培南改良平板上分别有８株、７株、２０株生长，检出率分别为４０％（８／２０）、３５％（７
／２０）和１００％（２０／２０）；接种菌液浓度为１０５ＣＦＵ／ｍＬ时，亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良平板上分别有３株、５株、１９株生长，检出率分别为１５％（３／２０）、２５％（５／２０）和９５％（１９／２０）；接种菌液浓度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ时，亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良平板上分别有２株、２株、
１９株生长，检出率分别为１０％（２／２０）、１０％（２／２０）和９５％（１９／２０）。见表３。
表３　３种改良麦康凯平板最低检测限评估
未生长
（株）
最低检测限（ＣＦＵ／ｍＬ）
１０８１０７１０６１０５１０４１０３１０２
合计
（株）亚胺培南改良平板６３３５１１０１２０美罗培南改良平板７３３２３０１１２０厄他培南改良平板０００１０１５１３２０
２．４　３种方法从粪便中筛查ＣＲＥ能力的比较　经确认，１４２份粪便样本中，共有５株ＣＲＥ，包括４株
大肠埃希菌及１株肺炎克雷伯菌。肉汤增菌法共检测出７株菌，其中包括５株ＣＲＥ（大肠埃希菌４株，肺炎克雷伯菌１株）及２株非ＣＲＥ（碳青霉烯类敏感的大肠埃希菌和恶臭假单胞菌各１株）；
ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基检测出５株ＣＲＥ（大肠埃希菌４株，肺炎克雷伯菌１株）和１株恶臭假
单胞菌；亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良麦康凯培养分别检出３株ＣＲＥ（大肠埃希菌）、２株ＣＲＥ（大肠埃希菌）、４株ＣＲＥ（大肠埃希菌３株，肺炎克雷伯菌１株），均未检出非ＣＲＥ菌株。
肉汤增菌法与ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基筛
查结果差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５，Ｋａｐｐａ＝
０．９１９）；３种改良麦康凯平板与肉汤增菌法筛查结果均一致，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）
，厄他培南改良麦康凯平板与其一致性（Ｋａｐｐａ＝０．７１７）高于亚胺培南（Ｋａｐｐａ＝０．５８８）与美罗培南（Ｋａｐｐａ＝
０．５６３）；３种改良麦康凯平板与ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ显培养基筛查结果均一致，差异无统计学意义
（Ｐ＞０．０５），厄他培南改良麦康凯平板与其一致性（Ｋａｐｐａ＝０．８８５）大于亚胺培南（Ｋａｐｐａ＝０．６５７）及美罗培南（Ｋａｐｐａ＝０．４８９）。
３　讨论
  本研究建立一种基于改良麦康凯平板的快速筛查ＣＲＥ的方法，同时利用临床菌株及粪便样本
评价其检测性能。结果显示，亚胺培南、美罗培南和厄他培南改良平板特异性分别为１００％、１００％和
９３．３３％，敏感性分别为９７．７８％、９５．５６％和１００％。本实验中发现４株仅检测出ｂｌａＴＥＭ的大肠埃希菌中
有１株未在亚胺培南改良麦康凯平板上生长，其他
３株却可以生长。目前已报道的ＣＲＥ相关耐药基因有很多种［６］，而本研究只检测了其中７种，该菌
株是否携带其他耐药基因或由其他耐药机制造成还未可知。有文献报道，碳青霉烯酶浓度［７］、亚型及相关β－内酰胺酶基因的表达差异［８］均会影响药物抑菌效果，这可能会导致携带不同耐药基因的同种菌株在３种药物改良平板上生长状况不同。用
２０株ＣＲＥ评估３种不同药物改良平板最低检测限时发现：不同菌株或不同基因型的相同菌株在同种
药物改良平板上生长的最低检测限略有差异，亚胺培南、美罗培南改良麦康凯平板最低检测限大多分布在１０５～１０８ＣＦＵ／ｍＬ接种水平，而厄他培南改良麦康凯平板最低检测限集中分布于１０２～１０３ＣＦＵ／ｍＬ。可见，厄他培南改良平板最低检测限优于亚胺培南及美罗培南改良平板。陈善建等［９］以ＫＰＣ型ＣＲＥ为主评估亚胺培南、美罗培南、厄他培南改良法国科玛嘉尿路显培养基最低检测限，也发现厄他培南平板具有更低的检测限。Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ等［１０］从药物结构及分子动力学的角度阐释了这３种碳青霉烯类药物抑菌效果存在差异的原因，并表明相较于厄他培南，美罗培南和亚胺培南细菌感染效果更好，这也为本实验中厄他培南改良平板上菌株更易生长提供了理论依据。
本研究中的３种碳青霉烯类药物改良麦康凯平板与肉汤增菌法及ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ培养基在筛
查肠道定植ＣＲＥ方面均具有一致性，尤其以厄他培南平板一致性更好。肉汤增菌法虽为美国ＣＤＣ推荐筛查方法，但其操作复杂、检测周期较长，不适用于大量筛查。而商品化的ＣＨＲＯＭａｇａｒＫＰＣ培养基由于价格昂贵，临床难以大规模推广。在现有报道中，鲜有评价自制平板性能并采用临床标本验证，且与肉汤增菌法及商品化方法的结果进行一致性评价报道。本实验后期仍需增加样本数量及类型进一步验证其筛查性能。
４　参考文献
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（收稿日期：２０２０ ０９ ０９）
（本文编辑：周万青，刘）

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