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176 •药学研究• Journal of Pharmaceutical Research 2021 Vol.40，No.3
•制剂研究•
三叶青片剂的质量标准研究
周煜恒I ，2，徐惠龙I ，2，苏澜I ，2，余佳敏1，许文l ，2* ，范世明l ，2* ，徐伟“2
(1.福建中医药大学药学院，福建福州350122;2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建福州350122)
摘要：目的研究三叶青片剂的质量标准，为其质量控制奠定基础。方法采用薄层谱（TLC)法鉴别三叶
青片剂中荭草苷、异荭草苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷及异牡荆素；采用三乙胺显紫外-可见分光光度（UV-Vk)
法，测定三叶青片剂中总黄酮的含量；建立高效液相谱（HPLC)法测定三叶青片剂中8个主要成分（荭草苷、异荭 草苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素、绿原酸、新绿原酸及隐绿原酸）的含量，Wekh Ukimate XB-C I8谱柱
(4.6 mmX 150 mm ，2.7 pm )，祥度洗脱，检测波长：330 nm ，流速:0.4 mL . min -1。结
果薄层谱法鉴别三叶青片
剂中荭草苷、异荭草苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素的展开剂为乙酸乙酯：曱酸：曱苯：水=8 :
1 : 1 : 1， A1C13显后紫外光365 nm 下检视；紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量，以牡荆素计，在1.85〜11.1邮.mL -1范 围内与吸光度值呈良好的线性关系，平均加样回收率为98.43%，兄为2.46%。建立的高效液相谱法，在考察的 浓度范围内，8个成分的浓度与峰面积呈良好的线性关系（r>0.999 0)，平均回收率为96.88%〜99.25%，兄为 1.94%〜2.47%。结论本试验建立薄层谱法鉴别三叶青片剂中荭草苷、异荭草苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷及异 牡荆素，用紫外-可见分光光度法测定三叶青片剂中总黄酮含量，用高效液相谱法测定8个主要成分含量，为三
叶青片剂的质量控制提供参考。
关键词：三叶青片剂；质量评价；薄层鉴别；含量测定
中图分类号：R 927文献标识码：A
文章编号=2095-5375(2021)03-0176-007
doi ：10.13506/j ki .jpr .2021.03.008
Study on quality standard of Tetrastigma hemsleyanum  Tablets
ZHOU Yuheng1’2 ,XU Huilong1’2 ,SU Lan1’2 ,YU Jiamin1,XU Wen1’2* , FAN Shiming1’2 *,XU Wei1’2 (
l.School of Pharmacy t Fujian University of Traditional Chinese Medicine f Fuzhou 350122 , China)
2.Centre of Biomedical Research & Development’Fujian University of Traditional
Chinese Medicine  ’F uzhou 350122 ’C hina
)
Abstract ： Objective To study the quality standard of the Tetrastigma hemsleyanum  Tablets (THT ) ’ and provide the
foundation for its quality control. Methods Using thin-layer chromatography ( TLC ) to identify orientin ’ isoorientin , vitexin ，vitexin-2-〇-rhamnoside and isovitexin in THT ;Triethylamine color development
with UV-Vis spectrophotometry was used to determine the content of total flavonoids in the THT ; High performance liquid chromatography ( HPLC ) was es­tablished to deter^nine 8 major components ( orientin ’ isoorientin ’ vitexin ’ vitexin -2- 〇-rhamnoside ’ isovitexin ’ chlorogenic acid ’neochlorogenic acid and cr^^ptochlorogenic acid ) ’Welch Ultimate XB-C 18 column (4.6 mmx150 mm ’2.7 ^m ) ’gradi­ent elution ’detection wavelength ：330 nm ’flow rate ：0.4 mL • min 1.Results TLC to identify orientin ’isoorientin ’vitexin ’ vitexin-2-〇-rhamnoside ’ and isovitexin in the THT using the developing agent ethyl acetate • for^mic acid • toluene • water =8 • 1 • 1 • 1 ’after AlC“ color development ’ inspection under ultraviolet light 365 nm ; UV-Vis method to determine the
基金项目：中央本级重大增减支项目（Wo .2060302)；福建省自然科学基金项目（Wo .2018W 0012、201810009)；中医药公共卫生服务补助专项 (Wo .财社[2019]39号）；福建省大学生创新创业项目（Wo .202010393028)；校管科研课题-平台项目（Wo .X 2019002-平台）；*同为通信作者 作者简介：周煜恒，男，研究方向：中药资源与质量评价,E -m ail :1034116708@ qq
通信作者：许文，男，博士研究生，研究方向：中药药效物质基础和作用机制研究,Tel **************,E -m ail :yaoxuexuweii @ 163 ；范世明， 男，高级实验师，研究方向：中药资源与质量评价,Tel :059卜22861135,E -m ail :r 3570379@ 163
total flavonokk content，there is a good linear relationship with the absorbance value at the range of 1.85-11.1 pg mL 1of vitexin,and the average recover^^was 98.43% with the RSD of 2.46%.The established HPLC method showed a good linear relationship between the concentration of the 8 components to their peak areas (r>0.999 0)within the investigated concen- tration.The average recovery was 96.88% ~ 99.25%，and the RSDs were 1.94% ~ 2.47%.Conclusion In this experiment，the TLC method for THT was established to identify orientin，isoorientin，vitexin，vitexin-2-0-rhamnoside and isovitexin in the THT;UV-Vis was used to deter^nine the content of total flavonoids，and HPLC Methods was used to deter^nine the con­tent of 8 components in the THT，which provided a reference for the quality control of it.
Key words：Tetrastigma hemsleyanurn Tablets;Quality standard;Thin-layer identification;Deter^mination
药学研究• Journal qf PharmMewtiad Research 2021 V〇!.40，N〇.3* 177*
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤(Tefrastigma hemsle;yan>u m Diels et Gilg)，别名金钱吊
葫芦，全草均可人药[1-2]，其地下块根又名蛇附子[3]。近年来，关于三叶青的现代药理作用研究较多，其在抗肿瘤[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]、降脂[7]、保 肝[8]等方面都显示出了良好的作用，并且现代化学研
究表明三叶青中的黄酮类成分是主要的活性成分[9]，且具有良好的安全性[9]，黄酮类成分被作为三叶青质量评价的重要指标性成分[10-14]。
近年来关于三叶青开发利用上，三叶青制剂多为汤剂或散剂[15-17]，但汤剂存在需临用前煎煮制备、药液味苦、量大、散剂未经提取纯化口服量大等缺点。中药片剂具有剂量准确、质量稳定、生产成本 低、服用和贮运方便等优点，课题组前期针对三叶青
开展了其片剂工艺的研究，制备得到的三叶青片剂[18-19]，但对三叶青片剂的质量控制尚未建立，也
未见文献关于三叶青片剂的质量评价研究。
为了更好地控制三叶青片剂质量，本研究根据
《中国药典》2015年版（四部）制剂通则中片剂项下规定对其进行片重差异、崩解时限及硬度检查，利用 薄层谱鉴别其主要黄酮成分，采用紫外分光光度法测定其总黄酮的含量，并采用高效液相谱测定三叶青片剂中8个主要成分的含量，建立三叶青片剂的质量标准，为三叶青片剂的开发利用提供参考。1仪器与试药
1.1仪器安捷伦1290高效液相谱仪（安捷伦
公司）；Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech 有限公
tablet5司）；CPA225D型十万分之一分析天平（德国
Sartorius公司）；KQ-500E台式超声波清洗器（昆山
市超声仪器有限公司）；UV-1800紫外分光光度计
(日本岛津公司）；TDP-1.5单冲压片机TDP-1.5
(上海超亿制药机械设备有限公司）；LB-2D型崩解
时限测定仪（上海黄海药检仪器厂）；YD-200B片 剂硬度测定仪(上海铭翔药检仪器有限公司）；硅胶 G预制薄层板（青岛海洋化工厂分厂，批号: 20180612)。1.2试药牡荆素（批号:MUST-160308)、异牡荆 素（批号：MUST- 150711 )、荭草苷（批号：MUST- 130705)、异荭草苷（批号：MUST-131009)、牡荆素 鼠李糖苷（批号：MUST- 130506)、绿原酸（批号: MUST-327979)、新绿原酸（批号:MUST-906332)和 隐绿原酸（批号:MUST-905997)均购自成都曼思特 生物科技有限公司，H P L C纯度均為98%。树脂HP20(日本三菱公司），聚维酮K30(PVP-K30)、乳 糖、微晶纤维素（MCC)、硬脂酸镁、羧甲基淀粉钠(CMS-Na)、交联聚维酮（PV PP)均为药用级（安徽 山河药用辅料股份有限公司）。甲醇、乙腈、甲酸均 为谱纯（Merck公司）；三乙胺为谱纯（阿拉丁试 剂上海有限公司），水为Milli-Q Direct 16超纯水机 制备（Millipore公司）。三叶青由宁化县益珍农业科 技有限公司提供，经福建中医药
大学药学院药用植物实验室范世明正高级实验师鉴定为葡萄科崖爬藤 属植物三叶崖爬藤（Tefrastigma hemsle;yan_um Diels et Gilg)的全草，药材存放于福建中医药大学药学院标 本室。
2方法与结果
2.1三叶青片剂制备依据课题组前期对三叶青提取、纯化和制剂工艺考察[18-19]，简述如下：三叶青 药材3 000 g，经粉碎机粉碎，过40目筛，得三叶青 粉，备用。将三叶青粉置于多功能提取罐中，加人 20倍量70%乙醇，回流提取90 min，提取2次，合并 滤液浓缩到生药计1g •mL-1的浓缩液。取HP20 树脂，以径高比1 : 5装柱，取三叶青浓缩液按照0.5 g生药/g树脂上样量上样后，静置1h，以流速6 BV •h-1(B V为树脂床体积）的超纯水进行除杂，用 量为4 BV。采用50%乙醇4 B V，以流速2 BV •h-1 进行富集洗脱，收集富集液浓缩，冷冻干燥24 h，平 行制备3批三叶青剂冻干粉。按照三叶青片剂制备，按照处方比例，三叶青冻干粉：填充剂=1:2，填充剂为微晶纤维素：乳糖=1 : 1.5，内加5%主药 量的崩解剂PVPP :CMS-Na=1:1，加人5%主药 量的用85%乙醇配制的3%PVP K30黏合剂，以
85%乙醇为润湿剂，“握之成团，轻捏即散”软材于 20目筛制粒，置于60 °C烘箱干燥、整粒，加入润滑 剂硬脂酸镁为颗粒量的0.6%，压制成片，即得3批三叶青片剂各1000片（每片折算生药约3 g)。
2.2性状3批次三叶青片剂均为棕片，味微 苦，表面光滑，泽均匀，见图1。
图1三叶青片剂外观性状2.3片剂项下的检查[20]
2.3.1片重差异根据《中国药典》2015年版（四
部）制剂通则中片剂项下重量差异的检查方法进行
检查，3批次的三叶青片剂平均片重分别为0.455 1、
0.453 0、0.454 7 g，重量差异均在±5%内，符合规定。
2.3.2崩解时限按照《中国药典》2015年版（四
部）崩解时限检查法进行检查，3批三叶青片剂崩解
时限均在15 m in内，符合《中国药典》规定。
2.3.3硬度检查片剂应具有适宜硬度，3批三叶
青片剂的平均硬度为26〜27 N，硬度符合规定。
2.4薄层鉴别
2.4.1供试品溶液取3三叶青片剂适量，研细，称取约0.5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，加25 mL 甲醇超声处理（功率250 W，频率50 kHz)30 min，放冷，滤过得供试品溶液。
2.4.2对照品溶液取牡荆素、异牡荆素、荭草苷、异荭草苷及牡荆素鼠李糖苷对照品适量，精密称定，加入甲醇制成浓度分别为0.465、0.429、0.414、0.499、0.445 mg •m L l勺单一对照品溶液，分别取各 单一对照品溶液1m L置于5 m L量瓶中，摇匀即得 混合对照品溶液。
2.4.3鉴别方法与结果分别吸取荭草苷、异荭草 苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素对照品溶液各2.0 p L，混合对照品溶液5 p L，供试品溶液各2.0 吣和5.0吣点于同一硅胶G薄层板上（青岛海洋），以乙酸乙醋：甲酸：甲苯：水=8:1:1:1
为展开剂系统展开（温度26 C，湿度65%)，取出晾 干，喷以3%A1C13显剂，于105 C下加热5 min，365 nm紫外灯下检视。结果表明三叶青片剂供试品薄层谱中与荭草苷、异荭草苷、牡荆素、牡荆素 鼠李糖苷、异牡荆素对照品同一位置上呈现相同颜的清晰斑点，阴性空白（单纯辅料片剂）无干扰，
2 3    4 5 67 89 101112 13
1.荭草苷;
2.异荭草苷;
3.牡荆素;
4.牡荆素鼠李糖苷；
5.异牡荆素；6、10.SYQP_ZS001(5、2 p L);7、11.SYQP_
ZS002(5、2 pL);8、12.SYQP_ZS003(5、2 pL);9.混合对
照品溶液;13.阴性空白
图2三叶青片剂5个黄酮类成分薄层谱图
结果见图2。
2.5三叶青片剂总黄酮含量测定
2.5.1供试品溶液制备取三叶青片剂适量，研 细，称取约0.05 g，精密称定，置具塞三角瓶中，加25 m L甲醇超声处理（功率250 W，频率50 kHz) 30 min，放冷，滤过得供试品溶液。另取等量空白片剂制备空白阴性溶液。
2.5.2对照品溶液制备精密称取牡荆素对照品22.2 mg，加入适量甲醇制得浓度1.10 mg •mL-1的 对照品储备液，进一步用甲醇稀释制成浓度46.25 pg mL-1的对照品溶液。
2.5.3显方法及检测波长的选择参考课题组之前建立的三叶青总黄酮测定方法[13]，精密吸取牡 荆素对
照品5 m L于25 m L的容量瓶中，加甲醇至6 mL，加1%三乙胺定容至刻度，摇勻，显30 min。精密吸取供试品溶液1m L于25 m L的容量瓶中，加 甲醇至6mL，加1%三乙胺定容至刻度，摇匀，
显
30 min。对照品和供试品溶液均以显剂作为空白 对照。在300-500 n m范围内进行扫描。结果显示，对照品与供试品溶液在400 nm处有相同吸收峰，故选择400 nm作为检测波长，见图3。
图3牡荆素（1)和供试品（2)的紫外光谱图谱
2.5.4线性关系考察精密吸取“2.5.2”项下的牡荆 素对照品各1、2、3、4、5、6 m L于25 m L容量瓶中，
加 甲醇至6mL，按“2.5.3”项下方法显测定吸光度，以对照品溶液的浓度与吸光度值建立标准曲线，得线性 回归方程4= 0.048 4C-0.022 4，= 0.999 3。结果表 明，在1.85-11.10网mL-1范围内线性关系良好。
2.5.5精密度试验精密移取对照品溶液5 mL，供 试品溶液1mL，分别置于25 m L容量瓶中，加甲醇至6mL，按“2.5.3”项下方法显测定吸光度，在同 一紫外分光光度计上连续测定6次，结果对照品溶液和供试品溶液及分别为0.03%、0.10%，表明试 验精密度良好。
2.5.6稳定性试验精密移取对照品溶液5 mL，供 试品溶液1mL，分别置于25 m L容量瓶中，加甲醇至6mL，按“2.5.3”项下方法显后分别在0、8、15、30、60、90、120、240 m in测定吸光度。结果表明，对 照品和供试品显产物在室温下30-240 m in内稳 定，及分别为0.67%、2.54%。
2.5.7重复性试验精密称取批号为SYQP_ZS001 的三叶青片剂6份，按“2.5.1”项下方法制成供试品 溶液，精密吸取1mL，置于25 m L容量瓶中，按 “2.5.3”项下方法显后测定吸光度，计算含量，结 果该批次的三叶青片剂中总黄酮含量平均为117.48 mg •g-1，似D为2.57%，说明重复性良好。
2.5.8加样回收试验取重复性试验同批三叶青片剂（SYQP_ZS001)0.025 g，精密称定，加人近似样 品总黄酮含量的对照品量（1 : 1)，按“2.5.1”项下方 法制成供试品溶液。精密吸取1m L置于25 m L量瓶中，按“2.5.3”项下方法显后测定吸光度，平行6 份。结果该方法平均加样回收率为98.43%，50为2.46%，
见表 1。
表1加样回收率试验
供试品取供试品中黄加人量测得量回收率平均回
样量/g酮含量/m g/m g/m g(%)收率（％)
0.025 1  2.949  3.3  6.21699.0
0.025 4  2.984  3.3  6.331101.4
0.025 2  2.960  3.3  6.21398.6
98.43
0.025 4  2.984  3.3  6.11895.0
0.025 3  2.972  3.3  6.15196.3
0.025 2  2.960  3.3  6.271100.3
2.5.9样品含量测定精密吸取“2.5.1”项下的3 批次供试品溶液各1mL，分别置于25 m L容量瓶中，按“2.5.3”项下显后测定吸光度，计算得制备的3个批次的三叶青片剂中总黄酮含量分别为117.48、124.02、112.56 mg •g-1。
2.6 HPLC-DAD测定三叶青片剂8个成分的含量2.6.1 谱条件采用Welch Ultimate X B-C18谱 柱(4.6 mmx150 mm，2.7 pm)；流动相为 0.1% 甲酸 水（A)-乙腈（B)，流速0.4 mL min-1，柱温30 °C，进 样量:5 叫，梯度洗脱:98%A(0~5min)，98%A— 90%A(5 ~ 15 min)，90%A—^88%A(15 ~ 30 min)，88%A—80%A(30~50 min)，80%A—98%A (50~65 min)；检测波长330 nm，对照品和供试品溶液中8个成分理论塔板数均大于5 000，谱分离良好，阴性无干扰（见图4)。
1.新绿原酸;
2.绿原酸;
3.隐绿原酸;
4.异荭草苷;
5.荭草苷;
6.
牡荆素鼠李糖苷;7.牡荆素;8.异牡荆素
图4混合对照品（A)和供试品（B
)谱图
2.6.2供试品溶液的制备取“2.5.1”项下制备的 3批次供试品溶液。
2.6.3对照品溶液的制备取新绿原酸、绿原酸、隐 绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、异牡荆素对照品适量，精密称定，加人甲醇制备浓度 分别为 1.273、1.15、1.092、0.66、0.593 6、0.318、0.596 8、0.599 6mg mL-1的对照品储备液，进一步用甲醇稀释 制备浓度为 127.30、115.00、109.20、66.00、59.36、31.80、59.68、59.96吨mL-1的混合对照品溶液。
2.6.4线性和范围精密吸取“2.6.3”项下制备的 混合对照品溶液，用50%甲醇分别稀释制备得到梯 度浓度的混合对照品溶液，精密吸取5 ^L进样，并 测定峰面积，以浓度X(A g •mL-1)对峰面积:F进行 线性回归，得回归方程和相关系数，并稀释不同浓度 对照品得各个化合物的定量限（S/N为10)和检测 限（S/N为3)，结果见表2。
2.6.5精密度试验精密吸取同一份对照品混合溶液5 +L，—天内连续进样6次，连续进样3 d，记录8 个成分的峰面积，其峰面积日内精密度和日间精密度 的范围均在  1.39%〜2.01%，表明精密度良好。
表2 8个待测物的回归方程、线性范围及定量限和检出限
化合物 回归方程相关系数
r
线性范围
/>g •mL-1
定量限
/>g •mL-1
检测限
/>g •mL-1
新绿原酸y二36.97U.900.999 912.73〜127.301.270.385
绿原酸 ^ 35.23X+8.640.999 911.50〜115.001.150.348
隐绿原酸 r二 35.37X+4.530.999 910.92〜109.21.090.330
异荭草苷y二32H+1.310.999 9  6.60〜66.001.100.333
荭草苷33.3壯-0.290.999 9  5.93〜59.361.1860.359
牡荆素鼠y, 34 941-192
李糖苷
0.999 7  3.18〜31.801.060.321
牡荆素 y: 41.071-4.270.999 9  5.97〜59.681.190.362
异牡荆素y: 43.0从-1.990.999 9  5.99〜59.961.200.363
2.6.6稳定性试验制备一份供试品，取该供试品 溶液分别于0、2、4、6、10、12和24 h进样分析，记录 8个成分的峰面积，其峰面积的K S f l范围均在0.86%〜1.46%，表明供试品溶液在24 h内稳定。2.6.7重复性试验精密称取同一批三叶青样品6 份，制备成供试品溶液进样测定峰面积，计算8个成 分的含量，其含量K S fl范围均在1.39%〜2.94%，表 明方法重复性良好。
2.6.8加样回收率试验精密称取已知含量的样品（SYQP_ZS001)0.025 g，平行6份，精密加人近似 1 :1的8个对照品，制备成供试品溶液进样测定峰面积，计算含量，见表3，得到平均回收率为96.88% 〜99.25%，KSD为 1.94〜2.47%。2.6.9样品含量测定取“2.5.1”项下供试品溶液, 进样5 ^L，测定峰面积，根据标准曲线计算其含量，结果见表 4。
表3 8个待测物的加样回收率试验结果
化合物
样品称量
/g
样品中
含量/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
(%■)
平均回
收率(％.)
0.025 40.271 80.254 60.529 3101.1
0.025 00.267 50.254 60.518 198.4
....0.025 10.268 60.254 60.523 5100.1
新绿原酸99.24
0.025 30.270 70.254 60.529 5101.6
0.025 00.267 50.254 60.516 297.7
0.025 10.268 60.254 60.514 196.4
0.025 4  1.239 8  1.15  2.387 099.8
0.025 0  1.220 3  1.15  2.340 897.4
0.025 1  1.225 1  1.15  2.361 098.8
绿原酸98.35
0.025 3  1.234 9  1.15  2.403 6101.6
0.025 0  1.220 3  1.15  2.336 397.0
0.025 1  1.225 1  1.15  2.323 095.5
0.025 40.158 20.163 80.318 297.7
0.025 00.155 80.163 80.314 696.9
…..0.025 10.156 40.163 80.318 398.8
隐绿原酸97.84
0.025 30.157 60.163 80.324 7102.0
0.025 00.155 80.163 80.314 096.6
0.025 10.156 40.163 80.312 095.0
0.025 40.620 50.66  1.280 7100.0
0.025 00.610 80.66  1.261 898.6
0.025 10.613 20.66  1.272 599.9
异荭草苷98.60
0.025 30.618 10.66  1.280 5100.4
0.025 00.610 80.66  1.256 897.9
0.025 10.613 20.66  1.238 794.8
0.025 40.134 10.118 720.251 699.0
0.025 00.132 00.118 720.248 197.8
0.025 10.132 50.118 720.246 796.2
荭草苷96.88
0.025 30.133 60.118 720.250 998.8
0.025 00.132 00.118 720.245 295.4
0.025 10.132 50.118 720.244 394.2
0.025 40.168 40.1590.329 0101.0
0.025 00.165 80.1590.323 098.9
牡荆素鼠0.025 10.16640.1590.324 099.1
98.51
李糖苷0.025 30.167 70.1590.3268100.1
0.025 00.165 80.1590.321 698.0
0.025 10.16640.1590.315994.0
0.025 40.530 40.596 8  1.130 2100.5
0.025 00.522 00.596 8  1.109 298.4
0.025 10.524 10.596 8  1.106 697.6
牡荆素98.10
0.025 30.528 30.596 8  1.122 399.5
0.025 00.522 00.596 8  1.104 297.6
0.025 10.524 10.596 8  1.091 095.0
0.025 40.18970.179 880.371 7101.2
0.025 00.18680.179880.364 999.0
0.025 10.187 50.179880.362 497.2
异牡荆素98.05
0.025 30.18900.179880.366 798.8
0.025 00.18680.179880.361 697.2
0.025 10.187 50.179880.358 294.9

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