scRNA-seq数据处理—文件格式小结
书籍翻译
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希望大家能有所收获！
⊙引言—关于课程
⊙scRNA-seq简介
⊙scRNA-seq原始数据的质控
正
文
处理原始scRNA-seq数据
3.3
文件格式
3.3.1 FastQC
FastQ是您将遇到的最原始形式的scRNASeq数据。所有scRNASeq方案都使用配对末端测序进行测序。Barcode序列可以在一个或两个reads中发生，这取决于所采用的protocol 。然而，使用独特分子标识符（UMI）的protocol 通常包含一个带有细胞和UMI barcode 和 adapters 但没有任何转录序列的read。因此，尽管实际上是成对末端测序，但reads将被比对为好像它们是单端测序的。
FastQ文件的格式如下：
>ReadID
READ SEQUENCE
+
SEQUENCING QUALITY SCORES
3.3.2 BAM
BAM文件格式以标准且有效的方式存储比对过的reads。人类可读的版本称为SAM文件，而BAM文件是高度压缩的版本。BAM / SAM文件包含标题。标题通常包括有关样品制备，测序和比对的信息; 和每个read的每个比对的制表符分隔行。
alignment行使用具有以下列的标准格式：
1.QNAME：read名称（通常包括UMI条形码）
2.FLAG：数字标记表示比对的“类型”，链接：所有可能的“类型”的解释
3.RNAME：参考序列名称（即染体读数被比对到了什么序列上）
4.POS：最左边的比对位置
5.ts 数组字符串转数组MAPQ：比对质量
6.CIGAR：read的匹配/不匹配部分的字符串（可能包括soft-clipping）
7.RNEXT：配对/下个read的参考名称
8.PNEXT：配对/下个read的POS
9.TLEN：模板长度（read被比对到的参考区域的长度）
10.SEQ：read序列
11.QUAL：read质量
可以使用samtools将BAM / SAM文件转换为其他格式：
samtools view -S -b file.sam > file.bam
samtools view -h file.bam > file.sam
一些测序设备会自动将您的read比对到标准基因组，并提供BAM或CRAM格式的文件。通常它们不会在基因组中包含ERCC序列，因此在BAM / CRAM文件中不会比对ERCC read。要量化ERCC（或任何其他遗传变化），或者如果您只想使用不同于通用pipeline中的任何比对算法（通常是过时的算法），那么您需要将BAM / CRAM文件转换回FastQs：
可以使用bedtools将BAM文件转换为FastQ。为了确保多比对reads的单个拷贝首先按read名称排序，并使用samtools删除次级比对。Picard也包含了一种将BAM转换为FastQ文件的方法。
# sort reads by name
samtools sort -n original.bam -o sorted_by_name.bam
# remove secondary alignments
samtools view -b -F 256 sorted_by_name.bam -o primary_alignment_only.bam
# convert to fastq
bedtools bamtofastq -i primary_alignment_only.bam -fq read1.fq -fq2 read2.fq
3.3.3 CRAM
CRAM文件类似于BAM文件，只有它们包含用于header中比对到的参考基因组的信息。这允许在每个read里的与参考基因组相同的碱基被进一步压缩。与BAM相比，CRAM还支持一些有损（lossy）数据压缩的方法以进一步优化存储。CRAM主要由Sanger / EBI测序设备使用。
CRAM和BAM文件可以使用最新版本的samtools（> = v1.0）进行转换。但是，这种转换可能需要将参考基因组下载到缓存（cache）中。或者，您可以从CRAM文件的header中的元数据（metadata）预先下载正确的参考基因组，或者通过与生成CRAM的人交谈，并使用'-T'指定该文件，因此我们建议在执行此操作之前设置特定的缓存位置：
export REF_CACHE=/path_to/cache_directory_for_reference_genome
samtools view -b -h -T reference_genome.am -o file.bam
samtools view -C -h -T reference_genome.fasta file.bam -am
3.3.4 手动检查文件
有时，手动检查文件可能很有用，例如检查文件来自正确样本的header中的元数据。'less'和'more'可用于检查命令行中的任何文本文件。通过使用“|”将samtools视图的输出到这些命令中，而不必保存每个文件的多个副本。
# counts the number of lines
wc -
samtools view -h file.[cram/bam] | more
# counts the number of lines in the samtools output
samtools view -h file.[cram/bam] | wc -l
练习
您已经获得了一个小的cram文件：am
任务1：此文件是如何比对出来的？使用了什么软件？使用了什么基因组？（提示：检查header）
任务2：多少reads被比对了/没被比对？总reads数是多少？有多少次级比对？（提示：使用FLAG）

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