制品说明
大肠杆菌经Ca2+处理后可摄取外源DNA (Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞 (Competent Cells)。在基因重组实验时，要经常使用感受态细胞进行转化操作，但制作稳定高效的感受态细胞却又十分困难。尤其是在制作基因文库、重组质粒体以及进行亚克隆实验时，特别是在目的基因含量十分低的情况下，使用高效的感受态细胞显得十分重要。
TaKaRa对Hanahan的方法进行了改良，并制作出了高效的感受态细胞。
细胞种类
1 高效常用宿主E. coli HB101
E. coli HB101是基因重组实验起始时便十分常用的宿主菌。其遗传性能稳定，使用方便，适合于各种基因重组实验。
2 α-互补性选择宿主E. coli JM109
E. coli JM109在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM109 F'编码的lacZ△M15相结合，从而显示β-半乳糖苷酶活性(α-互补性)。利用这一特性,
可以很容易鉴别重组体菌株。因为具有F'质粒，除可用于制作基因库、进行亚克隆等之外，也可作为M13载体DNA的宿主，制备单链DNA。
3 E. coli DH5α在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和DH5α编码的lacZ△M15相结合，从而显示b-半乳糖苷酶活性(α-互补性)。利用这一特性, 可以很容易鉴别重组体菌株。DH5α可以用于制作基因库、进行亚克隆等。
由于DH5α具有deoR变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。
质量标准
使用1 ng的质粒DNA进行转化时：
100 ml Competent Cells/1 ng pUC19 plasmid转化时产生的菌落数 >1×108 transformants/1 mg pUC19 plasmid
β半乳糖苷酶、α-互补性的确认
对E. coli Compatent Cells JM109/DH5α使用pUC19 DNA进行转化后，在含有100 mg/ml 的Ampicillin、0.2 mM的IPTG，40 mg/ml的X-Gal的L-琼脂平板培养基上，产生的白菌落占总菌落数的1%以下。100 ml的E. coli Competent Cells在含有100 mg/ml的Ampicillin L-琼脂平板培养基上不产生菌落。
BL21（DE3）感受态细胞：
BL21（DE3）感受态细胞是采用大肠杆菌BL21（DE3）菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化，转化效率大于1×108cfu/μg。
各位老师：我还得问个问题，我用的载体是PET-22b（+），宿主菌直接用的是Ｅ.coli BL21 ，我有个朋友说他们的载体也是PET-22b（+），都是直接用的，表达出来了。但我还是怀疑
是不是宿主菌一定得是BL21 DE3啊？那么把Ｅ.coli BL21 变成Ｅ.coli BL21 DE3怎么做呀？能告诉我具体的步骤吗？谢谢了！
假如楼主想自己进行溶源化，有专门的试剂盒卖的，不过用这种试剂盒来溶源BL21太不值得了，E.coli BL21 (DE3)这种菌应该很好的。
用BL21这种菌来作为克隆宿主菌，扩增质粒可以，但是假如想表达，必须是有DE3溶源的菌株，因为pET载体用到的都是T7启动子，野生大肠杆菌是不含有这种启动子的，只有用含有T7 启动子元件的噬菌体DE3溶源宿主菌，才能启动表达，否则很难表达。
异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，
免费网站制作全集很难有一个很完善或很标准的流程方法。
另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。
1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但比较常用的也就E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动
物细胞等，各自代表了一种体系。
  • 涵体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。
    酵母，有了比较完备的翻译后修饰系统，尤其是糖基化。但是个人感觉酵母表达异源蛋白时对蛋白本身的特点要求很大，有的蛋白表达量非常大，有的却几乎一点也没有，很折磨人。
    昆虫细胞和动物细胞本人没有做过，但园子里也有很详细的介绍，搜一下google也有不少，其中还有许多是画成了表格，对比各自的优缺点，网络不好，没链接，希望有人可以不全，
    多谢多谢！
    另外，也有很多用链霉菌表达的成功实例，不过个人感觉链霉做起来相当麻烦，周期长，转化困难，表达量也没什么优势，而且翻译后修饰虽然也有，但仍与真核差别较大。不过链霉菌有许多次级代谢产物（一些小分子物质）可能比蛋白表达本身更有意义
    2. 转化子、表达子的筛选
    转化子的筛选，由于许多质粒是穿梭质粒，因此大多具有E.coli中的抗性筛选标记，筛选起来是很方便的（当然，我不清楚细胞方面的筛选，一般使用病毒载体吧，希望高手们介绍一
    下）。
    但是转化成功的并不意味着能够成功表达目的蛋白了，因此还需要“表达子”的筛选，尤其是整合入基因组的片断（E.coli一般是游离质粒表达，好像不用再筛选了，有就有，没有就没
    有了）。我做的是毕赤酵母(GS115,pPIC9k)，在筛选过程中遇到了不小的问题，一般如果目的蛋白有些容易检测的特殊活性（比如抑菌活性），则筛选起来是比较容易的。但是如果没有，由于酵母是整合入基因组表达的，就不太好说了，我用原位点杂交的方法筛选过，效果不好，但筛选量倒挺大；还有就是5ml小量发酵筛选，工作量就比较大了，而且筛了
    400-500个也没有。
    还有就是发现不同的筛选方法获得的阳性菌株好像不是很平行，将上述筛到的菌株放大到100ml时就没有了。请教师兄，他说有可能是不同水平发酵溶氧量差别很大，导致酵母生长状态差异，酵母又挺娇气的，差一点也不干活，比较郁闷。不知有没有解决的方法。
    3. 稀有密码子
    由于是异源表达，不同宿主之间其密码子的偏好性就有不少的差异，这种差异经常直接导致了异源表达的失败。下面有几个问题，我有一些看法，希望大家能给与指导和帮助。
    首先，如何确定是否是该问题导致的表达失败。我的一位同学给了我个判断方法的建议，觉得很有道理，和大家分享讨论。他建议我在不同水平简单检测一下表达的情况：基因水平，做个PCR之类的看看是否已成功转入（质粒或整合入宿主）；做个半定量RT-PCR看看
    mRNA是否转录了；
    再看看SDS-PAGE是否有蛋白表达。如果根本转化就失败了，没有什么好说的；如果基因进去了但mRNA没有表达，可能需要考虑启动子的问题，换个强启动子或干脆换个质粒；如果mRNA转录了可没有蛋白翻译，那就需要考虑是否是密码子偏好性或mRNA二级结构
    的问题了。
    然后进一步查证，需要利用软件或上网查是否存在这样的二级结构，以及是否含有稀有密码子影响了翻译。在这个问题上我试着查了一些网站，如jp/codon/ ；gcua.schoedl.de/ ；bee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl。等等。但是许多东西看不太懂，理解起来有困难。希望能有软件高手详细介绍一下用法，尤其是能分析自己片断是否含有很多稀有密码子或二级结构等。在此感谢了！
    接下来就是如果确定有可能是稀有密码子问题如何解决？目前我见到的有两种方法，一是有些宿主比如大肠杆菌的Rosetta，是由BL21改造，整合了含稀有密码子tRNA的片断，使其能顺利表达的新型宿主菌，不知其他种类的宿主是否也有这种商业化的修饰菌；另外就是利用PCR等方法将片断上的稀有密码子改造（突变），换成其他编码同样氨基酸的密码子。
    当然，还可能干脆就换表达体系了，这一般是大家最不希望的了。
    4. 菌种的保存、退化
    一般来说是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。但是在做甲醇酵母时发现了个问题，就是重组工程菌的退化现象比较严重，一般都是学生做得好好的，但是毕业以后下面的师弟一接手，蛋白就不表达了，或表达量非常的低。连续好几个师兄的结果都是如此，很是奇怪。我猜测可能是由于整合入基因组，毕竟是个外源的基因，不知整合到了染体的什么部分，会不会过段时间就给“踢”下来，或就沉寂
    了？E.coli在复苏时都有抗性压着，酵母好像没有太合适的（不知pPICZ系列的那个抗生素好用不好用，但毕竟好贵
    ）。
    我有个想法，是否也应像公司在做工程细胞时那样，挑个几十上百个，一起传代，10几代后仍然稳定表达的才说明基因整合到了合适的部位，不会再下来了？
    5. 拷贝数对表达量的影响
    对于“游离”的质粒，比如E.coli的BL21表达时，质粒的拷贝数是否对表达量有所影响？当然，由于大肠表达最主要的问题经常是表达太高了形成了包涵体，所以说白了应该希望表达量更低点的可能比较多，经常尝试各种方法（低温、低浓度IPTG等等）来降低表达量。那么BL21中的质粒是否是单拷贝的呢（没查过，不太清楚）？如果不是，能否通过降低拷贝
    数来降低表达量防止包涵体的形成呢？
    至于酵母那种整合到基因组中的质粒，那么拷贝数是否对表达量有影响呢？通过我自己的经历，个人猜测还是有的。在上面讨论了菌种的退化问题，1年左右，重组的酵母表达蛋白就消失了。但是我曾经将这些蛋白表达消失的重组菌作了PCR鉴定，发现外源的片断仍然是存在的，就是不表达了，那么是什么
    原因呢？我有几种猜测：一是可能整合的位置恰好是染体的沉寂区了，过段时间以后就沉默了，不表达了；还有一种就是会不会是原来是高拷贝的重组菌在冻存以后退化了，变成低拷贝的了（也就是可能有蛋白表达但量很低了）。当然，我后来没有作进一步的验证，比如做个杂交确证以下拷贝数到底多少，只是一种猜测。
    那么，如何提高重组酵母菌的拷贝数呢？对于较早的PAO815质粒，采用的多是体外重组的方法达到高拷贝后再转化；对于pPICZ系列和pPIC9k等等则分别采用Zeocin和G418抗生素筛选的方法筛选高拷贝的质粒；园子里还讨论过一种多重转化获得高拷贝重组菌的方
    法也值得一试（如下）：
    www.dxy/bbs/actions/archive/post/870484_0.html
    www.dxy/bbs/post/view?bid=65&id=870387&sty=1&tpg=1&age=0
    www.dxy/bbs/actions/archive/post/871140_0.html
    毕赤酵母表达系统是应用最为广泛的酵母表达系统，近年来发展非常迅速，目前已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质，如破伤风毒素片段C、肠激酶、乙肝表面抗原、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等。其主要的优点有：1. 具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的
    启动子之一；2.外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在；3.高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且有利于产物的纯化；4. 菌株易于进行高密度发酵，
    外源蛋白表达量高，适于大规模工业生产。
    我的感觉是，如果想表达高度活性、高产量的真核来源的蛋白时，首选酵母，尤其你想工业
    化生产的时候，酵母更是第一选择。
    哺乳动物细胞表达同酵母表达相比，其最大的劣势在于成本和规模放大。首先，哺乳动物细胞表达时高表达细胞株的筛选是一个相当费时费力费钱的过程，由于外源基因整合位置的不同，导致不同克隆之间的表达差异相当巨大，因此建立一套完善的筛选体系是关键。第二点就是放大成本太大，细胞培养放大非常困难，成本相当高，其关键技术如培养基和流加工艺的控制，目前掌握好这些技术的人在国内屈指可数。
    但从另外一个方面讲，哺乳动物细胞表达的优势也是巨大的，首先用哺乳动物细胞表达人源蛋白，由于本身同源性相当强，因此，几乎不用怎么考虑蛋白活性的问题，而这一问题，恰恰是原核和酵母最为头痛的。因此在开发新药上，比其它系统用有无可比拟的优越性。另外，目前，随着哺乳动物细胞表达载体构建的进一步发展，随着细胞培养技术的提升，哺乳动物

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