缩略语表
缩略词英文全称中文全称
truncated模型用什么软件acid 氨基酸
Aa Amino
ATP Adenosine-triphosphate 三磷酸腺苷
pairs 碱基对
Bp Base
BSA Bovine serum albumin 血清蛋白
DNA 互补DNA cDNA Complementary
DEPC Diethyl  pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯
sulfoxide 二甲基亚砜DMSO Dimethyl
RNA 双链RNA dsRNA Double-stranded
dsRBD Double-stranded RNA binding domain 双链RNA结合域DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇
bromide 溴化乙锭
EB Ethidium
  • coli大肠杆菌
    acid 乙二胺四乙酸EDTA Ethylenediaminetetra-acetic
    GFP Green fluorescence protein 绿荧光蛋白
    peroxidase 辣根过氧化物酶HRP Horseradish
    pair 千碱基对
    Kb Kilo-base
    kD  Kilodalton 千道尔顿
    培养基
    medium LB
    LB Luria-Bertani
    miRNA MicroRNA 微小RNA
    RNA 信使RNA
    mRNA Messenger
    gel
    electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE Polyacrylamide
    PMSF    Phenylmethyl sulfonyl fluoride 苯
    saline 磷酸盐缓冲溶液
    PBS Phosphate-buffered
    PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应RISC RNA-induced silencing complex RNA诱导的沉默复合
    体
    RLC RISC loading complex RISC装配复合体
    干涉
    interference RNA
    RNAi RNA
    RNase Ribonuclease 核糖核酸酶
    Transcription 反转录
    RT Reverse
    SDS Sodium dodecyl sulphate 十二烷基磺酸钠shRNA Short haipain RNA 短发夹RNA
    siRNA Small interfering RNA 小分子干涉RNA 3’UTR  3’ untranslated region 3’ 非翻译区
    TRBP在RISC中作用的研究
    硕士研究生：李俊堂
    导师：杨安钢教授
    第四军医大学肿瘤生物学国家重点实验室
    第四军医大学生化与分子生物学教研室，西安 710032
    中文摘要
    RNA干涉（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（Double-Stranded RNA，dsRNA）介导的转录后基因沉默现象。双链RNA在细胞内被一种称之为Dicer的核酸酶的作用下，被剪切成含3’端两个突出碱基的约21~23nt 的小的RNA双链体，称之为小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA与Dicer等一些蛋白质相互结合，形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），根据碱基配对原理特异性识别与之同源的RNA分子，并将其降解。生物学研究发现RNA干涉在抗病毒感染免疫、维持基因组中转座子的稳定性、清除异常RNA和参与基因的表达调控方面发挥重要作用。鉴于其重要的生物学功能，RNA干涉
    已成为研究基因功能及基因靶向等方面的重要工具。尽管广为应用，但是RNA干涉的机制尤其是核心效应复合体RISC的形成过程尚不清楚。
    Survivin基因是凋亡抑制蛋白家族（IAP）成员之一，其基因定位于第17号染体，由4个外显子和三个内含子组成。Survivin基因编码蛋白为一
    种癌胚蛋白，在胚胎组织和各种肿瘤组织中均有表达。效应细胞蛋白酶体（EPR-1）为凝血蛋白酶因子Ҳa的受体，其基因也定位于17号染体，由1165个碱基组成，编码一337个氨基酸的蛋白，有关其蛋白表达的研究较少，目前仅发现部分血液系统肿瘤中有所表达。Survivin基因编码区与效应细胞
    蛋白酶体（EPR-1）基因序列反向互补，这一特征提示一个共表达Survivin
    和EPR-1的细胞将是我们研究RISC复合体链选择的天然模型。本文中构建
    的有关Survivin和EPR-1的荧光素酶报告基因系统为研究链选择机制提供了
    一定的条件。
    在2005年，参与哺乳动物细胞RNAi的明星分子TRBP(HIV-1 Tar RNA Binding protein )跃入人们眼帘。它正是一种双链RNA结合蛋白，早在上世
    纪末就被人们发现与HIV病毒对机体免疫细胞的抑制作用有关。在哺乳动物
    细胞中，它还被证实，作为Dicer的伴侣，不可或缺的参与了RNAi。TRBP 为含有三个dsRBD（double strand RNA binding domain）的蛋白。其中从N
    端开始的第三个dsRBD可以和Dicer相互作用。已有研究证实TRBP、AGO2
    和DCR在细胞内相互作用。体外实验试验也证实TRBP-AGO2-DCR的复合
    物可以加工pre-miRNA、识别向导链和随从链并且形成成熟的RISC。
    关于影响siRNA装载入RISC复合体的因素已有所研究，但是对双链RNA结合蛋白TRBP链选择的机制尚无研究。本研究中正确构建了全长、截
    短/重组型、突变型 TRBP基因的真核表达载体并筛选到了合适的物细胞模型。转染质粒pFLAG-CMV4、pFLAG-CMV4-TRBP、pFLAG-CMV4-TRBP AB、pFLAG-CMV4-TRBP BC、pFLAG-CMV4-TRBP AC、pFLAG-CMV4-    TRBPm到HEK-293细胞中，检测了全长和各种截短/重组体、突变体的表达，并且观察了全长和各种截短/重组型、突变型TRBP与Dicer，Ago2的相互作
    用情况，证实了缺失C片段的TRBP不能与Dicer结合，为研究TRBP的链
    选择提供一定的基础。另外，通过对RISC组分的干涉实验证实Ago2在RNAi
    过程中起着至关重要的作用。本文还从HEK-293细胞天然模型这一新的视角
    入手，研究RNAi过程中过程中效应链的选择，分别将适宜剂量的荧光素酶报告基因载体FL-Survivin、FL-EPR-1以及siRNA转染入HEK-293细胞，结果提示在RNAi过程中存在着一定的链选择效应。
    关键词：RNA干涉；Dicer；Ago2；TRBP；链选择；RISC

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