硒蛋白S截短和全长重组质粒的构建与表达
黄芙萌;赵莉;马芳霞;陈钊;王莉;田李芳
truncated 翻译
【摘 要】目的 构建截短和全长硒蛋白 S(SelS)重组体,以期在细胞系中或动物体内高表达并观察其生物学效应.方法 用基因重组技术构建SelS的截短体和全长的重组质粒,截短体基因只包含mRNA的编码序列(CDS),全长包括mRNA的CDS和3′非翻译区(UTR)序列,此序列中含硒代半胱氨酸的插入序列(SECIS).将重组质粒送公司测序并比对.用脂质体2000将硒蛋白SelS质粒转染至细胞中,24 h后观察绿荧光蛋白的表达,流式细胞技术检测细胞的转染效率;收集细胞用Trizol法提取总RNA,将mRNA反转录为cDNA,以此为模板用PCR扩增以观察目的基因的表达.结果 测序结果显示重组序列与目的基因完全一致,质粒构建成功.显微镜下可观察到细胞高表达绿荧光蛋白,经流式细胞技术验证细胞的转染效率达到40% 以上.PCR产物的凝胶电泳结果显示:与对照组及其他实验组相比,只有转染了目的基因的实验组高表达截短和全长的SelS基因.结论 成功构建SelS截短的和全长的重组质粒并转染入细胞中高表达,对观察硒蛋白截短体和完整形式在细胞系或动物体内的生物学效应提供了基础.%Objective To construct the recombinant plasmids of normal and truncated selenoprotein S genes so as to observe their biological fun
ction in vitro or in vivo.Methods We constructed the recombinant plasmids of normal and truncated selenoprotein genes by gene recombinant technology.The gene of truncated selenoprotein was coding domain sequence(CDS)fragment of mRNA;the gene of normal selenoprotein was CDS and 3'untranslated region(including Sec insertion sequence)fragment of mRNA.We confirmed the sequence of recombinant genes by sending them to a company for comparison.The recombinant plasmids of normal and truncated genes of SelS were transfected into cells by Lipofectamine 2000.After 24 hours,the expression of green fluorescent protein was observed and transfection efficiency was detected by FACS analysis.We collected the cells to isolate the total RNA by TRIzol method,and then cDNA was obtained by mRNA reverse transcription and amplified by PCR.Results The sequencing results showed that the recombinant genes were completely the same as the target genes,indicating that we constructed the plasmids successfully.The expression of green fluorescent protein could be observed and transfection efficiency was detected up to 40% by FACS analysis.PCR results showed that the target selenoprotein gene was highly expressed in the experimental group than in control group.Conclusion The
truncated and normal selenoprotein S genes were successfully constructed and transfected into cells where they were highly expressed.It lays foundation for observing the biological effect of truncated and normal selenoprotein in cell line or animal body.
【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2018(039)002
【总页数】5页(P276-280)
【关键词】硒蛋白S;截短体;基因重组;质粒构建
【作 者】黄芙萌;赵莉;马芳霞;陈钊;王莉;田李芳
【作者单位】西安交通大学第二附属医院肾病内科,陕西西安 710004;西安交通大学第二附属医院肾病内科,陕西西安 710004;西安交通大学第二附属医院肾病内科,陕西西安 710004;西安交通大学第二附属医院肾病内科,陕西西安 710004;西安交通大学第二附属医院肾病内科,陕西西安 710004;西安交通大学第二附属医院肾病内科,陕西西安 710004
【正文语种】中 文
【中图分类】R392
硒(selenium, Se)是多种生物体内不可缺少的微量元素。硒以硒蛋白形式在体内发挥其生物学功能[1]。硒蛋白的特征为蛋白中都有硒代半胱氨酸(selenocysteine, Sec)，人体内共有25种硒蛋白基因，编码超过30种硒蛋白[2]。硒蛋白S(SelS)是硒蛋白家族的主要成员，具有抗氧化损伤，参与内质网应激及炎症反应，参与精子发育过程等多方面的生物学功能[3]。人类SelS基因位于15号染体长臂上，其mRNA有2个转录变体，分别由1 250和1 292个碱基组成，它们均能编码由189个氨基酸残基组成的 SelS，其中第188位为Sec残基，是肽链中倒数第2位的氨基酸[4]。
Se元素以Sec的形式插入硒蛋白，此过程需要一个能将mRNA中的UGA密码子翻译成Sec的特殊机制，在硒蛋白mRNA 3′端非翻译区域(3′TUR)中存在一个茎环结构硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence, SECIS)，该结构在翻译过程中能使丝氨酰-tRNA上的反密码子ACU与密码子UGA交错配对[5]。在Sec特异性延长因子、SECIS结合蛋白2(SECIS binding protein 2, SBP2)、核糖体蛋白L30、RNA结合蛋白、可溶性肝脏抗原蛋白和硒磷酸
合酶1的辅助下，将Sec-tRNASec上携带的Sec插入到硒蛋白肽链中[6]。
硒蛋白作为机体内硒的最主要代谢形式，在硒缺乏与否的情况下存在两种剪接方式：一种是将UGA翻译为Sec插入硒蛋白肽链中，另一种是UGA作为终止密码子终止硒蛋白肽链的翻译。后者发生在细胞环境中缺乏合成原料硒时，硒蛋白的合成受到限制，而选择将UGA作为终止密码子终止硒蛋白肽链的翻译，不再插入Sec，形成羧基端缺失-Sec-Gly、无酶活性、截短的硒蛋白[7]。
本研究将模拟硒缺乏环境，构建能翻译出截短 SelS的重组质粒，同时构建其具有正常生物活性的全长 SelS的重组质粒，用于后续实验，以期观察硒蛋白S截短体和完整形式在细胞系或动物体内高表达的生物学效应。
1 材料与方法
1.1 材料 本实验在西安交通大学生物化学与分子生物学系实验室完成。pEGFP-C1真核表达载体、人宫颈癌细胞Hela细胞系及DH5α大肠杆菌菌种由本实验室留存。高保真Taq酶及DNA marker购于日本TaKaRa公司，PCR primers由北京三博志远公司合成，RevertAidTM First S
trand cDNA Synthesis Kit、ApaⅠ酶及XhoⅠ酶购于加拿大Fermentas公司，Gel Extraction System B VER2.0试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，T4 DNA连接酶购于美国Sigma公司，TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒购自北京天根生物技术公司，胰蛋白胨及酵母提取物购于英国Oxoid公司，DMEM高糖培养基购自赛默飞世尔生物试剂，胎牛血清及胰蛋白酶购自美国HyClone公司，Lipofectamine 2000及Trizol® Reagent购自美国Invitrogen公司，E.Z.N.A. Fastfilter Endo-Free Plasmia Midi Kit购于OMEGA生物技术公司，6孔板购于美国Corning公司，倒置相差显微镜及正置荧光显微镜购于日本Olympus公司，流式细胞仪(FACS)购于美国Guava Technologies公司。
1.2 SelS基因PCR引物的设计与合成 截短的SelS用trun-S表示。trun-S中PCR的目的基因片段为CDS部分，不包括5′UTR或者3′TUR；全长SelS中PCR的目的基因片段为CDS+3′TUR部分，不包括5′UTR，3′TUR中含有SECIS序列。设计引物时，先在GenBank上查出基因序列GenBank No.NM_018445.4，然后利用PRIMER-v5软件进行设计，引物设计好之后在GenBank数据库中利用BLAST 进行查询，确定与其他基因无同源性，为特异性序列。设计时引物的上下游分别引入与载体相应的内切酶位点，上游用核酸内切酶XhoⅠ，其识别序列为CTCGAG，下游用核酸内切酶ApaⅠ，其识别序列为GGGCCC。PCR引物由北京三博远
志生物技术有限责任公司合成(表1)。
表1 硒蛋白PCR引物信息
Tab.1 Primer information of selenoproteins
基因引物序列(5'～3')扩增长度(bp)退火温度(℃)SelS正义链CCGCTCGAGATGGAACGCCAAGAGG反义链GCGGGCCCTTAATATACAGAAACAAACCCCATC103460trun-SelS正义链CCGCTCGAGATGGAACGCCAAGAGGAGTC反义链GCGGGCCCTTAGCCTCATCCGCCAG58759
1.3 表达载体的选择 在表达载体pEGFP-C1的多克隆酶切位点上，选择与SelS基因两端对应的核酸内切酶位点XhoⅠ及ApaⅠ，两酶切位点之间的序列将被切除，插入本研究的目的SelS基因片段(图1)。
图1 pEGFP-C1载体结构和多克隆位点示意图
Fig.1 Schematic diagram of pEGFP-C1and its multiple cloning site
1.4 重组质粒的构建 建立PCR反应体系：5×Taq酶buffer 10 μL，正义链引物P1 1 μL，反义链引物P2 1 μL，模板0.5 μL，高保真Taq酶0.5 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 33 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 45 s，退火温度45 s，72 ℃ 1 min，34个循环后，72 ℃ 10 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳确定DNA大小为目的条带并且无其他杂带。

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