T-DNA整合机理和特征
1 植物基因组中T-DNA整合的一般特征
T-DNA插入是创造植物突变体的有效工具，但是T-DNA在植物基因组中的整合特点、整合机制以及两者之间的关系还不是十分清楚。早期对拟南芥和烟草等双子叶植物基因组和T-DNA 连接处的序列进行分析，研究结果显示，T-DNA在植物基因组的整合主要有以下特点：T-DNA 的整合无位点特异性，不需要长片段的同源性，属于非正常重组（Illegitimate recombination）；T-DNA的整合会在植物基因组的靶位点处产生13－73bp的缺失或者加入数十个碱基的填充序列；一般情况下，只有左右边界之间的T-DNA序列才能转移到植物基因组内，但T-DNA边界序列之外的T-DNA骨架序列也会整合到植物基因组内；T-DNA的左边界即单链T-DNA 3’端保守性不强，它同植物的整合位点有不少于5个核苷酸的同源性，整合T-DNA 的右边界同VirD2相连，具有很强的保守性，它同植物中整合位点的同源性可以只需仅仅一个碱基（即微同源）。
2 T-DNA整合模型
研究表明，解释T-DNA的整合机理主要有单链缺口修复（Single-stranded Gap Repair，SSGR）和双链断裂修复（Double-Stranded Breaking Repair，DSBR）两种模型（Gheysen等，1991；Matsumoto等，1990；Mayerhofer等，1991）。单链缺口修复模型如图7所示，单链T-DNA[3][4][5][6]的3’端有一段核苷酸与植物基因组DNA同源，首先T-DNA上的3’端与植物基因组上的同源区进行重组，同时被取代的植物DNA
链在（1）和（3）位置被内切酶消化，产生缺刻，并在3’位置处产生羟基位点。T-链3’端的单链部分也在（2）处被外切酶去除，接着T-链5’端（附着在VirD2上）结合到互补靶向链的微同源区域。同时5’端连接VirD2的磷酸酪氨酸键断裂，与靶位点处3’端的羟基形成磷酸二酯键。接着以T-DNA为模板，植物链上DNA游离的3’端为引物修复合成第二条链，从而使T-DNA共价整合到植物基因组中。这种模型表明T-DNA右边界序列在整合过程中比较保守，与靶位点没有同源性或只有单碱基同源，而左边界在整合过程中有缺失，并且与靶位点处有一小段同源序列（Tinland，1996）。
首先植物的双链DNA产生断裂，解旋的靶DNA通过与T-DNA末端的同源性与T-DNA退火，T-DNA 单链的未退火部分被外切酶或修复系统中单链特异的核酸内切酶去除。之后进行缺口的连接，完成T-DNA的整合。该模型表明T-DNA整合过程中左右边界部分都有部分缺失，大多数情况下右边界和靶位点有同源序列（Matsumoto等，1990；Mayerhofer等，1991）。
Brunaud等（2002）对9,000个拟南芥T-DNA上一页[3][4][5][6]标签进行分析，发现整合后的T-DNA左右边界与侧翼拟南芥基因组序列存在3－5 bp的微同源性，从而暗示了单链缺口修复机制在T-DNA整合到拟南芥基因组中起主要作用。而Tzfira等（2003）利用核酸内切酶在烟草基因组中产生双链断裂（DSB）位点，用以诱导T-DNA位点特异性的整合，结果发现T-DNA整合到DSB位点的频率（2.58%）远高于该位点的随机整合频率（4×10-9）；Chilton 和Que（2003）也用类似方法，证明T-DNA是通过非同源的末端连接（Nonhomologous End Joining，NHEJ）以双链的形式整合到烟草基因组中的DSB位
点；此外，大量的拟南芥转化植株的T-DNA与基因组DNA连接序列中也发现了填充DNA，这些也暗示着双链断裂修复模型也是T-DNA整合模式之一。在水稻转化系中Jeon等（2000）检测到填充序列以及复杂的整合方式，揭示了T-DNA在水稻中的整合也存在双链断裂修复机制。
3 T-DNA在水稻染体水平上的分布
在早期的研究中，一般都认为T-DNA在植物基因组的整合是个随机事件，并通过原位杂交的
truncate的特征结果加以证实（Iglesias等，1997）。随着研究的深入，T-DNA插入侧翼序列的大量分离，通过对T-DNA插入序列插入位点的分析，逐渐发现T-DNA在染体上的分布并不是完全随机的，尤其近年来对于T-DNA在染体上存在插入位点的偏爱性有了大量的报道。目前水稻中已经分离大量的T-DNA插入侧翼序列（Chen等，2003上一页[3][4][5][6]；An等，2003；Sallaud 等，2004；Jeong等，2006；Zhang等，2007；Hsing等，2007）。在染体水平上，早期认为T-DNA在各条染体之间分布并不存在明显的差异，但Sallaud等（2004）和Zhang等（2007）通过分离的大量侧翼序列的分析认为在第1、2和3号等几个偏大的染体上T-DNA插入密度要明显高于其他染体；就在染体不同部位而言，T-DNA倾向于插入到染体远末端区域，在着丝粒区T-DNA插入密度要远低于平均插入密度，推测这可能与染质状态有关，由于着丝粒区一般都是呈紧缩状态的异染质，可能不利于T-DNA的接触和整合（Ortega等，2002）。有研究发现，T-DNA在染体上的插入密度还和该区域的表达基因的密度呈现高度的正相
关，表明T-DNA倾向于插入到染体上基因富集的区域。这也说明了T-DNA的整合与染体自身的活跃程度相关。但是也有研究认为之所以造成这种T-DNA插入的“偏爱性”，是由于整合到异染质中的T-DNA由于选择基因的表达量低，常常在组培抗生素筛选的过程中被淘汰（Francis和Spiker，2005）。
在基因的水平上对T-DNA的插入进行分析，发现在拟南芥（Szabados等，2002；Alonso等，2003；Schneeberger等，2005）、水稻（Chen上一页[3][4][5][6]等，2003；An等，2003；Sallaud等，2004）、矮牵牛（Wang等，1995）和洋葱（Khrustaleva和Kik，2001）中，T-DNA 偏向插入基因的调控序列。但是对T-DNA的插入的偏爱性也有不同的结论：An等（2003）和Sallaud等（2004）通过对水稻T-DNA侧翼序列分析发现，在Intron和Exon的插入频率没有差异，Alonso等（2003）对拟南芥的序列进行分析也得出类似结论；但Chen等（2003）对1,009条水稻T-DNA侧翼序列分析发现T-DNA偏向插入到Intron内。Brunaud等（2002）在拟南芥中的研究结果也认为T-DNA偏向于插入到Intron内。对于T-DNA偏爱插入基因区还是基因间隔区，Chen等（2003）和Jeong等（2006）认为没有明显的差异。
就序列水平而言，拟南芥中曾经报道T-DNA优先整合到基因组中富含A/T核苷酸的区域。但在水稻中，通过对T-DNA侧翼序列的分析，发现基因组DNA的AT上一页[3][4][5][6]含量对T-DNA的插入没有影响（Chen等，2003；An等，2003；Zhang等，2007）。

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