·基础研究·SELEX法筛选鼻咽癌核酸适配子的研究
陈文学1，2，张焜和1，邹学森1，陈岳青1，李金高2
（1江西省肿瘤医院，南昌330000；2南昌大学第一附属医院）
摘要：目的建立鼻咽癌细胞核酸适配子库，为鼻咽癌的分子诊断、生物奠定基础。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA文库，采用SELEX技术，以正常鼻咽上皮细胞为靶标进行消减筛选，以EB病毒阳性低分化鼻咽癌细胞为靶标进行10轮筛选。采用流式细胞仪检测判断核酸适配子库的特异性和亲合力，Clustal X软件分析适配子序列。结果流式细胞仪检测显示亚文库与靶细胞的结合能力随筛选轮数的增加荧光强度增强。
聚类分析显示适配子可以分为3个家族，1、2家族具有保守序列。结论EB病毒阳性鼻咽癌细胞适配子库初步建立成功，可筛选到具有较高亲和力和特异性的核酸适配子；本研究为鼻咽癌的分子诊断、生物奠定了基础。
关键词：指数式富集的配体系统进化技术；鼻咽肿瘤，鼻咽癌；适配子
中图分类号：R739．6文献标志码：A文章编号：1002-266X（2012）23-0031-03
Study on selection of DNA aptamers to nasopharyngeal carcinoma cell by SELEX
CHEN Wen-xue1，ZHANG Kun-he，ZOU Xue-sen，CHEN Yue-qing，LI Jin-gao
（1Jiangxi Provincial Tumor Hospital，Nanchang330000，P．R．China）
Abstract：Objective To establish nasopharyngeal carcinoma（NPC）nucleic acid aptamer library for laying the foun-dation of NPC molecular diagnosis and biological treatment．Methods An in vitro synthesized78mer random DNA library was subjected to subtractive selection against normal nasopharynx epithelial cell and10rounds of selection against NPC cells by SELEX．Binding of the aptamer pools to NPC cells was visualized by flow cytometry technique．The aptamer se-quences was analyzed by clustal X．Results The subpools binding against NPC cells increased along with selection rounds．Aptamers were divided into three families by clustering analysis，and motifs were identified in1，2families by a-lignment．Conclutions We successfully established EB virus positive NPC aptamer pool，which can separate high affinity and specificity aptamers．This study lays the foundation of NPC molecular diagnosis and biological treatment．Key words：systematic evolution of ligands by exponential enrichment；nasopharyngeal carcinoma，nasopharyngeal cancer；aptamer
鼻咽癌早期症状不明显，多数患者发现时已为中晚期。寻早期诊断的生物标志物是目前研究重点。适配子是近年来公认的在疾病诊断和分子中非常有应用前景的分子探针。1990年Tuerk 等［1］报道
了指数式富集的配体系统进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SEL-EX）技术，其是一项新的组合化学技术，利用体外化学合成随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，即核酸适配子。2010年3月，我们采用消减SELEX技术和细胞SELEX技术筛选鼻咽癌细胞核酸适配子，并对其结
基金项目：江西省卫生厅课题资助项目（20081116）。
作者简介：陈文学（1975－），女，博士在读，研究方向：肿瘤分子诊断。E-mail：wenxuechen@yahoo．com．cn 构进行了初步分析，旨在建立鼻咽癌细胞核酸适配子库，为鼻咽癌的分子诊断、生物提供新思路。1材料与方法
1．1材料用于SELEX筛选的DNA随机文库由上海生物工程技术有限公司合成。文库两端为固定序列，中间为40个碱基的随机序列。PCR扩增所用的引物由Primer5．0软件设计，上游引物5'标记FITC荧光标记。引物序列如下：上游引物（B1）序列：5'-FITC-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3'，下游引物（B2）序列：5'-CGCAACGCTCGCTCATACT-3'。正常鼻咽上皮细胞株（NP69）及EB病毒阳性低分化鼻咽癌细胞株（C666）由中山大学附属肿瘤防治中心曾木圣教授赠送。无血清培养基keratinocyte-SFM、1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；Dulbecco's磷酸盐缓冲液，酵母tR-
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NA购自Sigma公司。洗涤缓冲液（含4．5g/L葡萄糖及5mM MgCl
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的Dulbecco's磷酸盐缓冲液），结合缓冲液（含有0．1mg/mL酵母tRNA和1mg/mL BSA的洗涤缓冲液）。
1．2适配子筛选参照文献［2］采用SELEX技术。
①文库预处理：单链DNA文库（1．25nmol）溶解于500μL结合缓冲液中，95ħ热变性5min，冰浴10 min。②细胞预处理：培养瓶中的细胞用洗涤缓冲液洗3次，用0．53mM EDTA液进行消化，收集细胞。
③消减筛选：将预处理的文库液与NP69对照细胞（2ˑ106/mL）4ħ孵育60min，收集与NP69不结合的核酸。④亚文库获得：用消减筛选收集的核酸为模板，FITC标记的引物进行不对称PCR扩增，回收单链作为第二轮筛选的亚文库。⑤亚文库筛选：将第二轮亚文库溶解于结合缓冲液中，95ħ热变性5 min，冰浴10min，与C666细胞4ħ孵育30min，洗涤缓冲液洗涤，95ħ热变性5min，获得与细胞结合核酸，通过不对称扩增获得下一轮文库。⑥高亲和力、高特异性适配子库：通过增加筛选条件的严谨性以获得高亲和力、高特异性适配子库。筛选时间从60min降至30min，洗涤液体积从0．5mL逐渐增至1．5mL，洗涤次
数从1次逐渐增加到5次，核酸与细胞的比例从100到400。此外在筛选过程中加入20%FBS和50 300倍的酵母tRNA以降低文库的非特异性结合。经过10个循环后亚文库和靶细胞结合强度不再增加则筛选终止。筛选条件见表1。1．3亚文库分析以收获的结合ssDNA为模板进行不对称PCR扩增，反应条件为94ħ预变性3 min，94ħ45s，68ħ90s，20个循环。制备变性胶，切胶回收ssDNA作为下一轮筛选的亚文库。将亚文库进行系列稀释，荧光定量PCR定量亚文库的量。亚文库的特异性：将3ˑ105个细胞（C666、NP69）重悬于200μL结合缓冲液中，与FITC标记的10轮亚文库冰浴30min。用0．7mL结合缓冲液洗2次，重悬于0．3mL结合缓冲液中。流式细胞仪检测荧光强度。亚文库的亲和力：将3ˑ105个细胞（C666）重悬于200μL结合缓冲液中，与FITC标记的各轮亚文库冰浴30min。用0．7mL结合缓冲液洗2次，重悬于0．3mL结合缓冲液中。流式细胞仪检测荧光强度。FITC标记的原始文库作为阴性对照。
1．4核酸适配子克隆、测序及一级结构分析第10轮筛选出的ssDNA适配子库用不带FITC标记的引物进行PCR扩增，扩增所得dsDNA条带单一且在目的片段78bp位置，送上海生工公司进行克隆测序，Clustal X软件进行序列同源性比对。2结果
2．1鼻咽癌细胞SELEX筛选应用C666鼻咽癌细胞共进行了10轮筛选，用正常鼻咽上皮进行1轮消减筛选。筛选过程中在结合缓冲液中加入了一定比例的酵母tRNA及BSA以封闭非特异性结合位点，去除非特异结合，提高筛选效率。随着筛选轮次的增加，筛选条件的严格性不断增加，即逐渐增加核酸与细胞的比例，缩短孵育结合的时间，增加冲洗次数、液量和时间。各轮筛选的具体条件见表1。
表1鼻咽癌细胞适配子的各轮筛选条件
轮次
ssDNA量
（pmol）
细胞数目
（ˑ105）
核酸/
细胞比
孵育时间
（min）
洗涤条件
（次数/液量）1130013100601次/0．5mL 28008100601次/0．5mL 34002200502次/0．8mL 44002200502次/0．8mL 54002200503次/0．8mL 63001300403次/1．2mL 73001300404次/1．2mL 83001300404次/1．2mL 93000．75400305次/1．5mL 103000．75400305次/1．5mL 2．2单链DNA文库的收获及分析两步法不对称PCR扩增可获得大量的ssDNA，同时变性胶可有效回收ssDNA作为下一轮筛选的文库，结果见图1。流式细胞仪成功监测到文库富集，见图2。
正则化工具包图1不对称PCR扩增获得亚文库
注：A：变性PAGE胶，M：20bp Marker，1：PCR产物；B：中性PAGE胶，M：20bp Marker，1：PCR产物；C：中性PAGE胶，M：20bp Marker，1：回收的亚文库，2：PCR
产物
图2文库的亲和力和特异性
注：A：各轮文库与鼻咽癌细胞C666结合的荧光强度；B：10轮文库与C666和NP69细胞结合的荧光强度
2．3核酸适配子克隆、测序及一级结构测序结果见图3。一级结构分析示所有序列无共同的保守序列，但可分为三个家族，其中2个家族有共同的保守序列（*标注），1个家族无保守序列。
3讨论
细胞SELEX是SELEX技术的一项衍生技术，其突出优点是在未知细胞表面分子标志的情况下寻
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家族
1
保守序列TTTT （G /T ）T G （T /G ）TT 家族
2
保守序列TT （T /G ）GT
图3
适配子同源性比对结果
出特异性识别细胞的适配子
［3，4］
。适配子与抗体的功能有诸多相似之处，但又优于抗体。适配子是
体外化学合成的，合成速度快，储存和运输方便，且
可行5'和3'端的核酸修饰［5］
，
无毒性、免疫原性，在血液中存在时间短，组织穿透性高。因此适配子在肿瘤诊断和等方面具有广泛的应用前
景
［6，7］
。细胞SELEX 技术目前已有不少报道。Shangguan 等［8］用细胞SELEX 技术筛选到小鼠肝癌细胞特异性的适配子；Chen 等［9］
筛选小细胞肺癌的核酸适配子时发现，此核酸适配子可与靶细胞以外的其他小细胞肺癌细胞系特异性结合，不与非小细胞肺癌腺癌、鳞癌、大细胞肺癌细胞系特异性结合。NP69细胞来源于人鼻咽的正常上皮永生化细
胞系，
C666来源于鼻咽癌患者的鼻咽癌细胞系。NP69与C666在形态学上相近，均属于鼻咽上皮细胞，而在生物学上有显著区别，一种是正常细胞，一种是肿瘤细胞。因此用C666作为筛选的靶细胞，用NP69作为阴性对照进行消减筛选可获得针对鼻咽癌细胞表面标志的适配子库。从适配子库中可进一步获得用于鼻咽癌诊断和的适配子。
DNA 适配子可形成发夹、假节等多种二级空间
结构，进而与靶物质形成稳定的复合物［9］
。在随机DNA 文库中存在各种结构的适配子，能识别自然界
中的各种靶物质。本研究采用含有40个碱基的随
机DNA 文库，实际库容量在1015 1016［10，11］
，通过细胞SELEX 技术筛选到与鼻咽癌细胞C666高亲和
力的适配子库，并对适配子库的亲和力和特异性进行了初步研究。鼻咽癌细胞表面存在复杂的蛋白结合位点，每个结合位点可通过氢键和范德华力与不同亲和力的适配子结合。筛选初始时因筛选条件不严谨，各种亲和力的适配子均存在，随着筛选轮数的增加，适配子筛选的条件越来越严谨，适配子间通过竞争结合位点将亲和力高的适配子筛选出来。
由图2A 可见，随着筛选轮数的增加亚文库与
C666细胞结合荧光强度逐渐增加，第6轮以后，亚文库中高亲和力的适配子所占的比例增高，结合到C666细胞表面的高亲和力的适配子随之增加，第10轮后适配子库与C666细胞结合的荧光强度不再
增加，说明适配子库与C666细胞结合达到饱和。
图2B 中10轮适配子库分别与C666细胞、NP69细胞结合进行适配子库的特异性分析，
C666细胞的荧光强度是NP69细胞的6倍，说明10轮适配子文库
具有一定特异性。
DNA 的保守序列又称基序（Motif ），作为结构域中的亚单元，其功能是体现结构域的多种生物学作用。本研究经过10轮筛选，随机DNA 文库得到明显富集。克隆测序后进行序列分析表明，所有适配子的随机区一级结构无共同的保守序列，但可分为
三个家族，
其中2个家族具有共同的保守序列，第1家族基序为TTTT （G /T ）TG （T /G ）TT ，第2家族基序
为TT （T /G ）GT 。基序在DNA 适配子形成功能结构域中起重要作用，每个基序代表DNA 适配子不同的
结构域，
同时决定了其结合不同的靶标位点。本研究建立了鼻咽癌适配子库，并对部分适配子进行了
同源性序列分析，此为今后鼻咽癌的分子诊断及生物奠定了基础。参考文献：
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