Cytometric Beads Array (CBA)
流式细胞仪微球捕获芯片技术
一、 BD CBA Flex Sets概述
流式细胞术是一种可以根据大小和荧光强度来区分不同的特征的颗粒的技术， BD™ CBA 系统包括一系列同样大小不同荧光强度的微球，可以同时检测单一样本如（血清、血浆或组织培养上清）中多种可溶性分析物。BD CBA方法采用微球免疫分析方法，利用流式细胞仪灵敏检测荧光信号的特点，分析样本中的可溶性物质。结合流式细胞术的宽广的荧光检测范围，和包被有不同捕获抗体的小球在悬浮液中高效的捕获分析物的能力，使得BD CBA可以在极少的时间内用极少量的样本就可以得到多个检测物的信息（较传统的ELISA方法有着极为突出的优点）。特异性的捕获小球、PE标记的检测抗体及标准品或测试样本形成三明治式复合物。流式检测完数据后导出FCS2.0格式的文件，再使用系统分析软件分析得出结果。BD™ CBA Flex Set软件是个开放式的、可选配的微球免疫分析为基础的系统。结合荧光结合方法，最优配对原则和直标PE荧光试剂，较好的保证客户对复杂的生物学样本进行一致的可靠的分析。使用PE直标的荧光检测试剂，可以避免其他一些分析方法中所使用的streptavidin-biotin-PE检测方法由于血清和溶解样本中内源性的生物素所带来的高背景缺陷。因此，BD™ CBA Flex Sets提供了一个灵活的检测方法，同时具有着最高的重复性、单一样本（如血清、血浆、组织培养上清、细胞溶解物等）同时做到多个分析物的定量检测。
BD CBA Flex Sets 和CBA一样同样具备检测样本量小、灵敏度高、重复性好、直接荧光标记易于使用、测量范围宽，且能同时测定多种成分，提高效率，节省时间等特点。与传统的ELISA方法相比，具有更多的优越性。
BD CBA Flex Sets on Flow Cytometer (FACSArray & FACSCalibur) BD™ CBA Flex Set 系统的微球本身的荧光通过近红外（NIR）和红（Red）检测通道接收。微球上的荧光染料可以同时被633nm和532nm的激光器所激发，NIR光也可用远红的通道接收。不过，由于PE的黄接收通道和远红之间的补偿原因，建议最好使用NIR和红（Red）同PE的黄接收通道同时使用。使
用BD FACSArray bioanalyzer可以同时容纳75个微球位置。
微球上的荧光物质也可用488/633nm的激光器激发，通过FL3(和Array上的NIR同一信号)/FL4(和Array上的Red同一信号)，PE通过FL2通道接收。对在635nm的激光器可以检测两个信号的任何一台流式细胞仪可以做到同时检测72-75丛的组合。BD Calibur 由于模拟信号处理的局限和它只能在635nm的激光器上接受到一种信号，使得它只能有较少的大概30左右丛的组合，以后会增加到50个左右。
由于其中一种染料由488 nm激光激发后FL3通道接收，要求做好补偿设置以保证FL2通道较强的信号不会泄漏到FL3通道影响到微球的位置。
二、 CBA原理与实验步骤
Figure 1. 示意图显示BD CBA Flex Set实验方法和微球的分布，捕获微球是同一大小、染有两种专利的染料复合物。根据它们特征性激发和发射光谱的特性，在流式通过不同的通道接收。
1.设定仪器条件
2.准备或变性细胞溶解物
3.用分析稀释液梯度稀释标准品
4.混匀并稀释CBA Flex Set捕获微球
5.每个分析管或微孔中加50ul的稀释好的CBA Flex Set捕获微球
6.稀释CBA Flex Set PE标记的微球，并取50ul到各管或微孔中
7.再加50ul的标准品或样本共孵育，避光室温4小时
8.洗涤
9.流式细胞仪检测
10.CBA FCAP Array TM分析软件批量数据分析
三、 CBA FCAP Array TM
分析软件
CBA FCAP Array TM分析软件使得BD CBA实验系统的实验设定和数据的分析极为简单方便。此系统可以检测样本中多种分析物（如各种蛋白和缩氨酸）的存在与否及他们的浓度含量，数据由合适配置的流式细胞仪和采集软件采集，以FCS2.0格式存储，然后用FCAP Array TM软件分析。微球的位置由各个聚集的体决定，每个体微球的报告抗体的荧光强度反映分析物的含量情况。FCAP Array TM软件可用于任何CBA分析系统(包括试剂盒及Flex Sets)，也可以用于非BD流式系统所采集的标准的FCS2.0格式数据。
软件能力
flex软件
定量分析
通过一系列已知浓度的标准品做出标准曲线，以此为基础来定量分析待测物的浓度。并且在此软件系统下，可以自由设定建立标准曲线的点数和重复数、设定样本数量和重复数。他分析的是FCS2.0格式的数据文件、由颗粒的集中信号区来决定属于同一体的微球、计算每特异性微球上结合上的荧光
探测抗体的中位荧光强度值，软件由标准品的浓度和对应的荧光强度做出标准曲线，并且这个曲线的得到可以依据多种不同的数学模型，由此最终得到我们所需的待测样本中的分析物的浓度。
定性分析
也可以由此定性的得出样本中某种分析物的有无，也可以同时分析单个样本中多种分析物的存在与否。同样也是对流式采集的FCS2.0格式的数据进行分析，由集中区的颗粒信号来区分不同特征的微球，计算其中位荧光强度值（MFI），根据参照品的数据来决定每种分析对象的阴阳性界限值，由此既可定性的得出我们所关注的分析物的有无。
FCAP Array Software Wizards
另外，FCAP Array 软件也是提供Experiment Wizard 和 Plex Wizard 的强有力的工具。这些可以方便的进行快速的CBA 实验的设定，尤其当联合使用BD FACSArray™ bioanalyzer 分析仪时，FCAP Array 软件可以输出供自动采集样本使用的所有实验设定。
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