沙芥SSR引物开发步骤
－磁珠富集法
器材：高速冷冻离心机、低温水浴锅、PCR仪、研钵和研槌、离心管（1.5ml和2.0ml）、移液及尖、PCR管、一次性橡胶手套、凝胶成像系统、超净工作台、涡旋振荡器、电泳仪、制冰机、高压灭菌锅、PH计、培养皿、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪。
试剂：琼脂糖、CTAB、β巯基乙醇（1mg/ml EB）、BufferI、PCR产物纯化试剂盒、NaCl、Tris-盐酸、溴乙淀、无水乙醇、异丙醇、NaOH、冰醋酸、甲醛、SSC、SDS、磁珠、1×TE、LB培养基（胰化蛋白冻、酵母提取物、NaCl、NaOH）、10×TBE、50×TAE、过硫酸氨（APS）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、浓硝酸、硝酸银、Na2S2O3、Na2CO3、尿素、TEMED。
接头引物序列：
SuperSN×24 Forward：5’－GTTAAGGCCTAGCTAGCTAGCAGAATC－3’
SuperSN×24 Reverse：5’－GATTCTGCTAGCTAGGCCTTAACAAAA－3’
质粒通用引物序列：
SP1：5’－GAGCGGATAACAATTTCACACAGG－3’
SP2: 5’－CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC－3’
磁珠简介：
磁珠，又称微表面，单分散度，聚苯乙烯和二乙烯基苯构成的超级磁性颗粒。含有一个磁芯（8±2×10－3cgs单位）。自经约3um。不同类型磁珠表面结合有不同的基团，如OH、NH2、OH(NH2)、COOH等。用于共价连接蛋白和核酸配体。如链霉亲和素磁珠，将吸附任何生物素标记的核酸或蛋白吸附在表面。
一、 总DNA 提取
一般用DNA 提取试剂盒提取，浓度>100ng/ul，总量>50ul，去除RNA。
二、 酶切（产生平末端）
酶切体系：
1. BSA(10ng/ml) 0.25ul
2. NEBuffer 2.5ul
3. RsaI 1.0ul
4. XmnI 1.0ul
5. DNA 20 or 10ul
6. ddH2O 0 or 10ul
Total 25ul
上述体系在37℃水浴条件下（或培养箱，或PCR仪中）温浴2.5～4h。1%琼脂糖电泳检测（Marker 对照），smear 带集中分布在500～1000bp区间即可。
将上述酶切产物在65℃水浴中灭活15～30min，以使酶彻底失活。
三、 Adaptor 制作
体系：
1. ddH2O 3.6ul
2. SuperSN×24Forward(100uM) 1.4ul
3. SuperSN×24Reverse (100uM) 1.4ul
4. NaCl(1.2M) 0.6ul
Total 7ul
上述体系在PCR仪中95℃变性5min，关机自然冷却到室温。
四、加接头（连T4-ligase）
体系：
1. 酶切产物(第二步) 19ul
2. T4-ligase Buffer 3.0ul
3. T4-Enzyme 1.0ul
4. Adaptor(第三步) 7.0ul
Total 30ul
上述体系在16℃水浴条件下过夜（>9h）
五、 连接产物PCR扩增（扩增带接头的DNA片断）
用体系A或体系B（正常PCR）
体系A: 体系B:
1. SuperSN×24Forward(100uM) 1.3ul 1. SuperSN×24Forward(100uM) 1.3ul
2. 连接DNA片断（第四步） 2.0ul 2. 连接DNA片断（第四步） 2.0ul
3. BSA(牛血清蛋白) 0.5ul 3. dNTP(100mM) 0.4ul
4. Premix Taq 酶 12.5ul 4. 10×Buffer 2.5ul
5. ddH2O 8.7ul 5. BSA 2.5ul
Total 25ul 6. rTaq 酶 0.1ul
7. ddH2O 14.6ul
Total 25ul
采用通用的PCR 程序：
1. 72℃ 2min
2. 95℃ 2min
3. 95℃ 20s
4. 60℃ 20s
5. 72℃ 1min 3. 25
6. 15℃ 10min
7. 4℃ forever
和Marker 对比，进行4～7ul PCR 产物检测，300～500bp之间为理想产物。
六、 DNA-Probe 杂交
杂交体系：
1. 2×hyb solution 25ul
2. 6种probe的混和液 5ul （取每种probe 各1ul，混和后取5ul混和液）
3. Linker ligata DNA 20ul （其中第四步连接产物10ul，第五步PCR 产物10ul）
杂交程序：
1. 95℃ 5min
2. 70℃ 5s 2. 99 -0.2℃
3. 50℃ 10min
4. 50℃ 5s 4. 20 -0.5℃
5. 15℃ 10min
杂交试剂（下一步用）
1. 1×TE
2. Wash solution I: 2×SSC:0.1%SDS=1:1
3. Wash solution II: 1×SSC:0.1%SDS=1:1
4. 2×hyb solution: 12×SSC:0.2%SDS=1:1
5. 1×hyb solution: 6×SSC:0.1%SDS=1:1
七、 磁珠富集（DNA吸收）
1. 取原装磁珠，摇匀，吸取50ul 至1.5ml Epdorf 管
2. 加入250ul 1×TE 混匀，MPC 振荡磁珠，静置1-2min
3. 重复2
4. 加入50ul 1×hyb solution（现配），振荡，MPC捕获
5. 重复4
6. 加入150ul 1×hyb solution，溶解磁珠
7. 将DNA（＋探针）加入磁珠Epdorf 管中，混匀，于150rpm 振荡1h
打开40℃、50℃、95℃水浴锅
8. MPC 捕获，吸去上清
9. 加400ul wash solution I 混匀，MPC 捕获
10. 加400ul wash solution I，混匀，MPC 捕获
11. 加400ul wash solution II，40℃轻摇，2min，MPC捕获
12. 加400ul wash solution II，50℃轻摇，2min，MPC捕获
13. 加400ul wash solution II，45℃轻摇，2min，MPC捕获
14. 加400ul wash solution II，45℃轻摇，2min，MPC捕获
15. 加200ul 1×TE，混匀，95℃轻摇5min，MPC捕获，取上清（目的DNA片段）
（磁珠回收：磁珠加1×TE 60ul，于-20℃保存）
16. 向上清中加入22ul NaAc（3M的醋酸钠）混匀，再加冷冻无水乙醇445ul，于-20℃沉淀1h
17. 4℃，12000rpm，离心15min，弃上清
18. 70%乙醇洗涤，10000rpm 离心5min
19. 加入25ul ddH2O 溶解
八、 产物富集及吸收（PCR）
体系：
1. FJ-DNA 0.4ul
2. Premix Taq 12.5ul
3. BSA 0.625ul
4. Super SN×24F(100uM) 1.3ul
5. ddH2O 10.2ul
Total 25ul
或用下面体系：
1. FJ-DNA 1-2ul （终浓度0.5uM）
2. rTaq 酶 0.1-0.2ul
3. BSA 0.625ul （终浓度25ug/ml）
4. 10×Buffer 2.5ul
5. dNTP（100mM） 0.4ul （终浓度150nM）搭建ssr服务器教程
6. Super SN×24F(100uM) 1.3ul
7. ddH2O 18.1ul
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