基于SSR标记的大明松天然体遗传多样性分析
作者：罗凤　冯源恒　吴东山　杨章旗
pines
来源：《广西植物》2022年第08期
        摘要： 大明松是广西和贵州特有的高山松类，具有很高的经济价值和生态价值，其自然种长期没有得到充分的保护和利用，不利于该树种长期稳定发展。为了合理保护和开发利用大明松天然遗传资源，该文利用12个SSR分子标记对大明松3个天然体进行遗传
多样性研究，分析其體间的遗传分化和基因流，为该物种的保护策略提供参考。研究结果表明：（1）12对引物共检测到37 个等位基因，多态位点百分率为100%。每个位点平均观察等位基因数（Na）为3.08，平均有效等位基因数（Ne）为1.68， 不同位点间有效等位基因数差异较大;每个位点平均观察杂合度（Ho）为0.35，平均期望杂合度（He）为0.40，平均多态信息含量（PIC）为0.31。（2）3 个体的Shannon’s多样性指数变化范围为0.48～0.65，Nei’s基因多样度的变化范围为0.27～0.39，与其他近缘种松类相比遗传多样性偏低。体平均观察杂合度为0.40，平均期望杂合度为0.33，平均有效等位基因数为1.58。体间基因分化系数（Gst）为0.10，体间的遗传分化水平较低，大部分变异均存在体内。体间的基因流（Nm）为2.74，说明大明松体间的基因交流比较充分。该研究可为大明松生物多样性保护提供重要参考依据，为科学利用大明松资源打下基础。
        关键词： 大明松， 天然体， 遗传多样性， 遗传分化， SSR分子标记
        中图分类号： Q347文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2022）08-1367-07
        Genetic diversity of Pinus taiwanensis var. damingshanensis
        natural populations by SSR markers
        LUO Qunfeng， FENG Yuanheng， WU Dongshan， YANG Zhangqi
        （ 1. Guangxi Institute of Forestry Science， Masson Pine Engineering Technology Research Center of SFA （State Forestry
        Administration）， Masson Pine Engineering Technology Research Center of Guangxi， Nanning 530002， China ）
        Abstract： Pinus taiwanensis var. damingshanensis is a kind of endemic alpine pine of Guangxi and Guizhou， which has high economic and ecological values. Its natural population has not been fully protected and utilized for a long time， which is not conducive to long-term stable development of this species. In order to rationally protect and exploit the natural genetic resources of P. taiwanensis var. damingshanensis， 12 SSR markers were used to study the genetic diversity of three natural populations of P. taiwanensis var. damingshanensis， and to analyze the genetic differentiation and gene flow among populations， so as to provide reference for the protection strategy of this species. The results were as follows： （1） A total of 37 alleles were detected by 12 pai
rs of primers， and the percentage of polymorphic loci was 100%. For every site， the average number of observed alleles （Na） was 3.08， and the average number of effective alleles （Ne） was 1.68. The number of effective alleles varied greatly among different loci. The average observed heterozygosity （Ho） was 0.35， the average expected heterozygosity （He） was 0.40， and the average polymorphism information content （PIC） was 0.31 for every site. （2） The Shannon’s information index of the three populations ranged from 0.48 to 0.65， and the Nei’s gene diversity ranged from 0.27 to 0.39. Compared with other related species of pines， the genetic diversity was low. For each population， the average observed heterozygosity was 0.40， and the average expected heterozygosity was 0.33，the average number of effective alleles was 1.58. The genetic differentiation coefficient （Gst） among populations was 0.10. Most of the variation existed in the population and the genetic differentiation level among populations was low. The range of gene flow （Nm） was 2.74， indicating that gene exchange between populations is sufficient of P. taiwanensis var. damingshanensis. This study can provide an important reference for the protection of biodiversity， and lay a foundation for the scientific utilization of P. taiwanensis var. damingshanensis.
        Key words： Pinus taiwanensis var. damingshanensis， natural population， genetic diversity， genetic differentiation， SSR molecular marker
        大明松（Pinus taiwanensis var. damingshanensis）为松科（Pinaceae）松属（Pinus）植物，因1974年首次在广西大明山发现而得名，1975年由中国裸子植物分类学家郑万钧、傅立国等鉴定并发表于《植物分类学报》（郑万钧等，1975）。它是黄山松（Pinus taiwanensis）在我国西南分布区的一个变种（中国科学院中国植物志编辑委员会，1978;梁盛业，1994），它们之间的区别在于大明松叶内兼有中生与边生树脂道，而黄山松只有中生树脂道（樊国盛和薛纪如，1993）。大明松主要分布于广西、贵州海拔1 000 m以上的高山，自南向北分别是广西的大明山、大瑶山、银竹老山以及贵州的雷公山、云台山、梵净山、大沙河等地，总体呈不连续点状分布。大明松喜光，适应凉爽、空气湿度较大的高山气候，在土层深厚、排水良好的酸性土及向阳山坡生长良好，耐瘠薄，但生长迟缓。大明松材质坚实，富含树脂，可制作家具、器具、板材等，也可作建筑、矿柱及木纤维工业原料等，为西南高海拔地区重要的用材造林树种，且其树形姿态优美，亦是重要的景观树种。
        由于长期被人们忽视，大明松没有被系统地利用与保护，种分布状况、遗传多样性水平、自然更新能力都缺乏系统、针对性的调查与研究。目前，对大明松的研究报道很少，仅贾婕等（2019）通过比较研究大明松、马尾松、细叶云南松、拉雅松的种实性状，分析了这4种松树的繁育对策及交配系统状况;冯源恒等（2019）对广西和贵州的大明松种质资源进行调查，摸清了黔桂两省（区）大明松种质资源的分布特征，但没有对其体遗传多样性水平进行分析与评价。因此，亟须对现存的大明松天然体遗传资源进行多样性研究。
        遗传多样性是生物体长期进化的产物，是其生存适应和发展的前提。遗传多样性越高，遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强。因此，对其进行研究有助于生物体的保护与利用。目前，遗传标记是研究遗传多样性最常用的手段，其中SSR（simple sequence repeat）标记是多态性最高，也是应用最广泛的遗传标记之一。周海兰等（2021）用23对SSR多态性引物对收集的54份油梨种质材料进行PCR扩增，分析了这些种质资源的遗传多样性和亲缘关系;臧明月等（2021）利用SSR分子标记对白栎天然居进行遗传多样性分析，为其种质资源的合理开发与保护提供指导;陈罡等（2020）利用10对新开发的蒙古栎特异的核SSR分子标记，分析了辽宁省境内分布蒙古栎天然体的遗传多样性
水平;陈林杨等（2020）利用SSR分子标记技术对取自不同地方的35份柚种质资源进行遗传多样性分析，为柚资源的保护、品种鉴定及遗传改良提供借鉴与依据。
        鉴于此，本文利用SSR分子标记对大明松天然体开展遗传多样性研究，分析其多样性水平及遗传分化情况，将有力加强对稀有树种的保护力度，促进生物多样性保护与生态环境建设，为科学利用稀有松类资源打下坚实基础。因此，研究我国黔桂地区大明松天然体遗传多样性具有重要理论和意义。
        1材料与方法
        1.1 材料
        實验材料包括3个天然体，分别为广西大明山体、贵州梵净山体、贵州大沙河体（表1）。其中，大明山体（DM）取自广西大明山国家级自然保护区仙人台（108°25′54″—108°25′58″ E、23°30′12″—23°30′13″ N），属南亚热带湿润山地季风气候。无霜期292～312 d，日照时间长，光热充足。夏湿冬干，干冷同期，湿热同季，气候垂直变化明显（冯源恒等，2019）。
        梵净山体（FJ）取自贵州梵净山国家级自然保护区棉絮岭（108°39′46″—108°39′52″ E、27°54′45″—27°54′46″ N），属中亚热带湿润山地季风气候。无霜期270～278 d，相对湿度平均达80%（冯源恒等，2019）。
        大沙河体（DS）取自贵州大沙河国家级自然保护区甑子岩（107°35′04″—107°35′09″ E、29°08′13″—29°08′22″ N），属北亚热带湿润季风气候。大沙河地形北高南低，最高海拔1 939.9 m，最低海拔560 m，平均海拔1 400 m，相对湿度88%（冯源恒等，2019）。
        每个体按照株距30 m，采集30株以上样本。因大明山体空间较小，仅采集到26株。将采集的针叶装入离心管，填充硅胶进行干燥处理，便于保存。
        1.2 方法
        1.2.1 大明松DNA提取方法采用改良的CTAB裂解—硅珠吸附法（Doyle & Doyle，1990）提取大明松针叶DNA并纯化，通过琼脂糖凝胶电泳（1%浓度）抽样检测样本DNA 质量，采用紫外分光光度计测定各样本DNA浓度，稀释至统一浓度后置于-20 ℃环境保存备用。
        1.2.2 大明松SSR引物来源及PCR反应条件研究所使用的SSR引物是根据马尾松基因组DNA 测序所得序列设计开发获得（冯源恒等，2016），并使用8个大明松DNA样品进行引物筛选，选取主带清晰且有多态性的引物12对，用于本实验的体遗传多样性研究。引物设计由上海捷瑞基因技术有限公司合成，Taq酶、dNTPs等也购自该公司。
        PCR反应体系为10 μL：10 mmol·L-1 pH 8.0Tris-HCI，50 mmol·L-1 KCI，2.5 mmol·L-1 Mg2+，0.2 mmol·L-1 dNTPs，2.5 pmol引物，0.08 U Taq聚合酶，10～20 ng DNA。扩增反应程序：94 ℃4 min;94 ℃15 s，55～60 ℃15 s，72 ℃30 s，25 cycles; 72 ℃延伸20 min结束PCR反应（冯源恒等，2016）。
        Key words： Pinus taiwanensis var. damingshanensis， natural population， genetic diversity， genetic differentiation， SSR molecular marker

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