猪流行性腹泻病毒(PEDV)DR13株N蛋白
和M蛋白的分离纯化
谢春芳1，胡忠俊2，于瑞嵩1，董世娟1，陈冰清1，李震"
(#上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海201106；
2安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036)
摘要：本研究使用Ver。细胞复苏繁殖猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)DR13株，并通过蔗糖梯度超速离心、SDS-PAGE电泳纯化PEDV DR13株的N蛋白和M蛋白。结果PEDV DR13株具有致Ver。细胞病变能力,TCID50为10$12/mL；获得的PEDV DR13株N蛋白和M蛋白的质量浓度分别为119.3"g/mL和66"g/mL，为后续研究奠定了基础°
关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；N蛋白；M蛋白；纯化
modulate猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可感染各年龄段猪而引发严重腹泻、脱水，甚至死亡,1#3日龄患猪的死亡率可达100%，成年患猪体重下降、消瘦，给养猪业造成巨大的经济损失山。
PEDV属甲型冠状病毒，即a冠状病毒，是有包膜的单股正链RNA病毒，全长约28kb，至少有7个开放阅读框(ORF1a、ORFlN、ORF2、ORF3、ORFR、ORF5和ORF6)。ORF1a和ORFlb编码复制酶聚蛋白，该蛋白能被蛋白酶裂解为16个非结构蛋白(nsp1〜nsp16)；ORF3编码1种辅助蛋白，ORF2、ORFR、ORF5和ORF6分别编码纤突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N等R种结构蛋白PEDV N蛋白是病毒的核衣壳蛋白，相对分子质量为55000〜58000，是PEDV的主要结构蛋白，能包裹病毒RNA形成螺旋核糖核蛋白；该蛋白还参与病毒的转录，抑制宿主细胞生长，激活宿主内质网应激，抑制宿主&干扰素的产生以及宿主干扰素刺激基因(Interfere onstimulateing gene,ISG)的表达。PEDV与其他冠状病毒共感染时，各病毒的N蛋白之间存在互争、互换、相容等作用#7$。PEDV M蛋白是病毒的一种跨膜蛋白，相对分子质量约为2R000，具有装配、出芽等作用，同时能刺激宿主细胞产生免疫应答。
本实验通过蔗糖梯度离心和SDS-PAGE电泳法获得PEDV DR13株的N蛋白和M蛋白，为后续的相关实验研究奠定了基础。1材料与方法
1.1主要试剂与仪器
PEDV DR13株和Vero细胞由上海市农业科学院畜牧兽医研究所保存，兔源抗PEDV N蛋白抗体为上海越业生物科技有限公司产品，兔源抗PEDV M蛋白抗体为上海安驰生物科技有限公司产品，二抗(HRP
标记羊抗兔IgG)为上海碧云天生物技术有限公司产品，蔗糖(S1888-500G)为美国Sigma公司产品，PEG6000为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，蛋白的浓度检测试剂盒(Pierce"™BCA Protein Assay Kit)为美国Thermo 公司产品，精密电子天平为美国OHAUS产品，超速离心机(XPN-80)为美国Beckman公司产品，垂直蛋白电泳仪和半干转膜仪(Trans-Blot SD)为美国Bio-rad公司产品。
1.2PEDV DR13株的增殖
将100TCID"的PEDV DR13株接种于80%单层Vero细胞上，5%CO Z,37［条件下培养至50%细胞发生病变，收取细胞培养物，冻融2〜3次, 5000g(R［)离心5min，取上清，即为PEDV DR13粗提液；Reed-Muench法测定PEDV DR13株粗提液的tcid50值〔10$。
1.3PEDV DR13株的纯化
PEDV DR13粗提液100000g(R°C)离心2h，弃上清；沉淀用1mL PBS重悬，转移至离心管中，然后用注射器依次缓慢加入质量分数为20%、0%
基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字［2015］第6-1-9号)作者简介：谢春芳(1969—)，女，硕士，兽医师，主要从事动物免疫研究。*通信作者,E-mail：Zhenli6O@163
和60%的蔗糖各1.3*L,100000g（4°C）离心2h；吸取病毒条带，加入4mL PBS，再次100000g （4C）
离心2h，弃上清，200"L PBS重悬沉淀，即得纯化后的PEDV,-80C保存备用。
1.4SDS-PAGE检测
纯化的PEDV DR13株加入等量2\SDS凝胶
加样缓冲液，煮沸10min,15%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染。
1.5Western blot检测
SDS-PAGE胶半干时，9V条件下进行PVDF 转膜1h；利用5%脱脂奶粉TBST溶液封闭，4C 过夜；加入一抗（兔源抗PEDV N蛋白抗体、兔源抗PEDV M蛋白抗体）室温孵育1h,TBST洗涤；再加入二抗（HRP标记羊抗兔IgG）室温孵育1h,TBST 洗涤；滴加DAB底物显，观察结果。
1.6蛋白的纯化及质量浓度测定
用适量的0.25mol/L KC1溶液染SDS胶5min，割胶取相应位置的N蛋白和M蛋白条带，各带切碎后分别装入煮沸的透析袋（MW3500），加入15mL PBS,60V正向电泳2h,30V反向电泳5min，利用PEG6000进行浓缩，收集蛋白。
蛋白的质量浓度测定按照试剂盒说明操作。
2结果与分析
2.1PEDVDR13株复苏结果
使用Vero细胞复苏繁殖的PEDV DR13株具有致Vero细胞病变能力，TCID“为10512/mL。
22PEDV DR13株蔗糖密度梯度超速离心分离纯化PEDV DR13株粗提液经蔗糖密度梯度超速离心处理,PEDV聚集于质量分数为40%（密度1.17g/mL）和60%（密度：1.28g/mL）的蔗糖之间，可以看到清晰的病毒条带，符合PEDV的浮密度1.17g/mL特性。
2.3PEDV DR13株SDS-PAGE电泳检测结果
分离出的病毒经过SDS-PAGE电泳，在相对分子质量57000和24000处各有1条清晰条带（图1）
2*4PEDV DR13株蛋白Westernblot检测结果PEDV DR13蛋白转移到PVDF膜上后，先分别孵育兔抗PEDV N蛋白和兔抗PEDV M蛋白一抗，再孵育带HRP标签的抗兔IgG二抗，DAB底物显，在相对分子质量57000和24000处各有1条条带（图2）。Western blot结果证明分离蛋白是PEDV的N蛋白和M蛋白。
36000
28000
18000
10000
M DR13Vero
250000
130000
95000
72000
55000
图1SDS-PAGE电泳图
图2蛋白Western blot免疫印迹图
2.5纯化蛋白的质量浓度
绘制标准曲线如图3，分离纯化获得的PEDV N蛋白和M蛋白的质量浓度分别为119.3"g/mL
图3蛋白标准品的标准曲线
3讨论
PEDV是引起仔猪腹泻的一种烈性传染的肠道冠状病毒。其中N蛋白是病毒蛋白含量最丰富的
蛋白之一，是一种保守的重要核蛋白，具有维持病毒RNA结构的功能；M蛋白在病毒的装配和出芽过程中起重要的作用;PEDV M蛋白和N蛋白还具有抑制宿主细胞免疫应答，从而使病毒逃逸宿主细胞免疫应答的功能[1112]…
本实验通过蔗糖密度梯度离心纯化获得的PEDVDR13病毒株，可用于PEDV DR13全病毒蛋白结构形态分析、全长基因序列分析，也可用于以病毒作为抗原包被的PEDV抗体检测，以及动物攻毒免疫实验；通过SD&PAGE分离纯化获得PEDV N蛋白和M蛋白，二者质量浓度分别为119.3"g/
*L、66.0"g/mL，可以用于以蛋白作为抗原包被的PEDV 抗体的ELISA检测、抗PEDV的动物免疫实验等，也可用于与宿主细胞的免疫因子相互作用等后续研究。总之,PEDVDR13及其N蛋白、M蛋白的分离纯化对于PEDV的研究意义重大。
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