克隆是英文clone的音译,简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式,常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆,这门生物技术叫克隆技术。 将clone一词由名词转化成动词,并将核移植称为 nuclear cloning(核克隆),通过基因工程得到DNA分子的无性系称为molecular cloning(分子克隆)。在这里克隆是一种实现无性繁殖(asexual reproduction)的操作,是一种显微操作或分子生物学操作,而不是一般意义上的无性繁殖(或无性繁殖操作)。这也许正是克隆一词能够存在而不被无性繁殖替代的原因。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中,利用微电流刺激等使两者融合为一体,然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎,当胚胎发育到一定程度后,再被植入动物子宫中使动物怀孕,便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造,那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。英文「clone」在中国大陆音译为克隆,在台湾与港澳一般意译为复制或转殖,是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。前者「克隆」如同copy的音译「拷
贝」,有不能望文生义的缺点;而后者「复制」、「转殖」虽能大概表达clone的意义,却有不够精确并易生误解之憾。「clone」源于希腊语的「klōn」(嫩枝)。在园艺学中,「clon」一词一直沿用到20世纪。后来有时在词尾加上「e」成为「clone」,以表明「o」的发音是长元音。近来随着这个概念及单字在大众生活中广泛使用,拼法已经局限为「clone」。转植通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的的无性生殖方式(如植物)。一个转植就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。转植可以是自然转植,例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体(就像同卵双生一样)。但是我们通常所说的转植是指通过有意识的设计来产生的完全一样的转植。在生物学上,转植通常用在两个方面:转植一个基因或是转植一个物种。转植一个基因是指从一个个体中获取一段基因(例如通过PCR的方法),然后将其插入另外一个个体(通常是通过载体),再加以研究或利用。转植有时候是指成功地鉴定出某种显性的基因。所以当某个生物学家说某某疾病的基因被成功地转植了,就是说这个基因的位置和DNA序列被确定。而获得该基因的拷贝则可以认为是鉴定此基因的副产品。转植一个生物体意味着创造一个与原先的生物体具有完全一样的遗传信息的新生物体。在现代生物学背景下,这通常包括了体细胞核移植。在体细胞核移植中,卵母细胞核被除去,取而代之的是从被转植
生物体细胞中取出的细胞核,通常卵母细胞和它移入的细胞核均应来自同一物种。由于细胞核几乎含有生命的全部遗传信息,宿主卵母细胞将发育成为在遗传上与核供体相同的生物体。线粒体DNA这里虽然没有被移植,但相对来讲线粒体DNA还是很少的,通常可以忽略其对生物体的影响。转植在园艺学上是指通过营养生殖产生的单一植株的后代。很多植物都是通过转植这样的无性生殖方式从单一植株获得大量的子代个体。[编辑] 转植进展包括细胞核移植在内的现代转植技术已经成功地在一些物种上进行实验(以时间为序):蛙: 1962年,未成功鲤鱼: 1963年,中国科学家童第周早在1963年就通过将一只雄性鲤鱼DNA插入来自雌性鲤鱼的卵成功转植了一只雌性鲤鱼,比多利羊的转植早了33年。但由于相关论文是发表在一本中文科学期刊,并没有翻译成英文,所以并不为国际上所知晓。(源自:PBS) 绵羊: 1996年,桃丽(Dolly) 猕猴: 2000年1月,Tetra,雌性 猪: 2000年3月,5只苏格兰PPL小猪;8月,Xena,雌性 牛: 2001年,Alpha和Beta,雄性猫: 2001年底,CopyCat(CC),雌性 小鼠: 2002年 兔: 2003年3-4月分别在法国和朝鲜独立地实现;骡: 2003年5月,爱德荷Gem,雄性;6月,犹他先锋,雄性 鹿: 2003年,Dewey 马: 2003年,Prometea,雌性 狗: 2005年,韩国首尔大学实验队,史纳比 尽管转植研究取得了很大进展,目前转植的成功率还是相当低的:多利出生之前研究人员经历了276次失败的尝试;7
0只小牛的出生则是在9000次尝试后才获得成功,并且其中的三分之一在幼年时就死了;Prometea 也是花费了328次尝试才成功出生。 而对于某些物种,例如猫和猩猩,目前还没有成功转植的报导。而狗的转植实验,也是经过数百次反复试验再得来的成果。多利出生后的年龄检测表明其出生的时候就上了年纪。她6岁的时候就得了一般老年时才得的关节炎。这样的衰老被认为是端粒的磨损造成的。端粒位于染体的末端。随着细胞分裂,端粒在复制过程中不断磨损,这通常认为是衰老的一个原因。然而,研究人员在转植成功牛后却发现它们实际上更年轻。分析它们的端粒表明它们不仅是回到了出生的长度,而且比一般出生时候的端粒更长。这意味着它们可以比一般的牛有更长的寿命,但是由于过度生长,它们当中很多都过早夭折了。研究人员相信相关的研究最终可以用来改变人类的寿命。
DNA 提取的过程和方法
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时,先把DNP抽提出来,再把P除去,再除去细胞中的糖,RNA 及无机离子等,从中分离DNA 。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中,几乎不溶解,如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低,仅为在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加溶解度也增加,至1mol/L氯化钠中的溶解度很大,比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小,在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此,在提取时,常用此法分离这两种核蛋白。
2.细胞的破碎
细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方法有三种:①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法:用SDS处理细胞; ③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可使细胞壁破碎。
由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中,所以提取时有两个困难(高等植物与此类似):
①破碎细胞难;从处死动物٠分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DN ase降解,而动物组织:特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器,易造成DNA 断裂。
②分子量大,一般比细菌的大2—3个数量级,比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料,
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小,在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此,在提取时,常用此法分离这两种核蛋白。
2.细胞的破碎
细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。方法有三种:①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法:用SDS处理细胞; ③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可使细胞壁破碎。
由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中,所以提取时有两个困难(高等植物与此类似):
①破碎细胞难;从处死动物٠分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DN ase降解,而动物组织:特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器,易造成DNA 断裂。
②分子量大,一般比细菌的大2—3个数量级,比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料,
要根据具体情况选择适当的分离提取方法。
3.DNA提取的几种方法
(1).浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.
(clone2).阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中D
3.DNA提取的几种方法
(1).浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.
(clone2).阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中D
NA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.
(3).苯酚抽提法:
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 .
( 4).水抽提法:
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.
(3).苯酚抽提法:
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 .
( 4).水抽提法:
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.
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