基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第10期，第4596-4603页
研宄报告
Research Report
基于嗜氢产甲烷菌代谢的沼气异位生物提纯及其菌组成分析
汤晴w缪恒锋口黄振兴口徐锦w赵明星0阮文权口
1江南大学环境与土木工程学院，无锡,214122; 2江苏省生物质能与减碳技术工程实验室，无锡,214122
*通信作者，*******************
摘要本研究对餐厨垃圾厌氧发酵产生的沼气进行异位生物提纯，研究发酵和提纯过程中的反应特性，并 对提纯过程中的微生物变化进行分析。餐厨垃圾高固态厌氧发酵产生的沼气中C H4浓度为54.7%, C02浓度 为24.1%。累积沼气产量不断增加，挥发性脂肪酸浓度呈先上升后下降趋势。通过外源添加H2对发酵产生的 沼气进行异位生物提纯，提纯后的气体中C H4浓度提高到96.1%，而C02浓度降低到1.8%，印浓度仅为 0.3%，H2转化率达到99%以上。通过高通量测序对提纯过程中的微生物进行分析，
结果表明嗜氢产甲烷菌在 提纯过程中选择性富集，Met/ia«ocit以eits和A/ei/i.a no6acterium在反应结束时丰度最闻，而嗜酸型产甲院菌的 相对丰度不断降低。由于嗜氢产甲烷菌的高度富集，提纯体系中微生物数量减少，微生物多样性降低。实验结 果表明，利用嗜氢产甲烷菌的代谢作用能有效提高C H4浓度。
关键词厌氧发酵，沼气，生物提纯，嗜氢产甲烷菌
Ex-situ Biogas Biological Upgrading Based on Hydrogenotrophic Methanogens Metabolism and Its Microbial Composition Analysis
Tang Qing]2Mi a o Hengfeng1,2H u a n g Zhenxing12X u Jin12Zhao Mingxing Ruan W e n q u a n12
1 School of Environment and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi, 214122;
2 Jiangsu Engineering Laboratory for Biomass Energy and Carbon Reduction Technology, Jiangnan University, Wuxi, 214122
* Corresponding author, *******************
DOI: 10.13417/j.gab.039.004596
Abstract In this study,the biogas produced from food waste by anaerobic digestion were ex-situ biological upgraded.The aim of the study was to investigate the reaction characteristics during anaerobic digestion and biogas upgrading,and to analyze the microorganisms in the upgrading process.The concentration of C H4and C02was 54.7% and 24.1% in the biogas produced from food waste by anaerobic digestion.The cumulative biogas production increased continuously,and the concentration of volatile fatty acids showed a trend of f i r s t increase and then decrease.The biogas produced by the anaerobic digestion was ex-situ upgraded by external addition of H2. The C H4concentration was increased to 96.1%, while the C02concentration was decreased to 1.8%, and the H2 concentration was only0.3% which i t s conversion rate was over99%after biogas upgrading.The microorganisms were analyzed in the upgrading process through hi^i-throughput sequencing.The results showed that the hydrogenotrophic methanogens were selectively enriched during upgrading process,and Methanoculleus and Methanobacterium had the highest abundance at the end of the reaction,while the relative abundance of acetotrophic methanogens was continuously decreased.D u e to the enrichment of hydrogenotrophic methanogens,the quantity of microorganisms and the microbial diversity in the upgrading system was reduced.The experimental results showed that the concentration
基金项目：本研究由国家自然科学基金(51508230; 51678279)资助
引用格式：Tang Q.，Miao H.F., Huang Z.X_, Xu J” Zhao M.X.，and Ruan W.Q., 2020, Ex-situ biogas biological upgrading based on hydrogenotrophic methanogens metabolism and its microbial composition analysis, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 39(10): 4596-4603 (汤晴，缪恒锋，黄振兴，徐锦，赵明星，阮文权,2020，基于嗜氢产甲烷菌代谢的沼气异 位生物提纯及其菌组成分析，基因组学与应用生物学，39(10): 4596-4603)
基于嗜氢产甲烷菌代谢的沼气异位生物提纯及其菌组成分析4597
沼气产量变化进行研宄(图1)，
发现C H 4浓度在前7天 迅速提高到56.7%，并在后续反应中保持稳定，最终 C H 4浓度为54.7%。而C 02浓度在第3天达到最大的 58.6%，但随着反应的进行不断下降，最终为24.1%。
餐厨垃圾在发酵前期快速水解酸化，为产甲烷菌提 供底物，但随着产甲烷菌的富集，产酸与产甲烷达 到平衡，沼气产率变缓。发酵过程中累积沼气产量不 断增加，由第1天的65m L /g V S 上升到第29天的236.3 m L /g V S 。反应前7天的累积沼气产量占总产量 的74%，这与课题组之前的研宄类似(Gao  et  al ., 2015)。
1.1.2挥发性脂肪酸浓度变化
挥发性脂肪酸(V F A )是有机质在厌氧发酵过程 中水解酸化的产物，同时也是产甲烷菌代谢的底物,
V F A 浓度过高会出现酸抑制现象。对挥发性脂肪酸 在反应过程中的变化趋势进行研宄(图2)，发现V F A  浓度在前7 d 迅速提高到丨9 759 m g /L ，但随着反 应的进行浓度不断降低，反应结束时V F A 浓度为
4 222 m g /L ，仅为最高时的21.4%。反应开始时由于
餐厨垃圾中的有机质大量水解酸化，V F A 迅速积累;
但随着产甲烷菌的大量繁殖，挥发性脂肪酸被迅速
~ I
I  I  I  I  I  I  I  I  I  I  I  I  I
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29
时间(d )
Time (d )
Time (d )
图1厌氧发酵过程中的气体组分及累积沼气产量变化
Figure 1 The change of gas content and cumulative biogas pro­duction during anaerobic digestion
厌氧发酵技术是处理有机固体废弃物的重要方法 之一，并且可产生能源气体-沼气。餐厨垃圾具有高有 机质、易降解等特点，使其成为厌氧发酵的良好底物。 通常情况下厌氧发酵产生的沼气中含有大量c o 2 (25%〜50%),C 02的存在降低了沼气的热值(2.1 xl 04〜 2.8x 104kJ /m 3)，限制了沼气的利用方式(Weiland ^ 2006)。 如能将沼气中的C 02去除，C m 浓度可提纯到95%以 上，达到生物甲烷的品质。生物甲烷不仅能作为天然气 的替代品，还能用作汽车燃料等(Deng  and  H a g & 2010)。
目前，有研宄表明利用嗜氢产甲烷菌的代谢作 用对沼气进行生物提纯是一种清洁高效的方法 (Lombardi  and  Camevale ，2013)。根据公式在沼气的 生物提纯过程中嗜氢产甲烷菌将c o 2和H 2直接代 谢为C H 4和H 20，不仅提闻了 C H t 的含量，而且无副 产物产生。进行相分离的异位甲烷提纯不仅不会破 坏厌氧发酵体系原有的微生物平衡，而且通过嗜氢 产甲烷菌的单独富集会使提纯过程更高效。在生物 提纯过程中，由于纯菌体系对反应的要求较高，会出
现微生物污染和提纯效率不高等问题(Martin  et  al .，
2013; Seifert  et  aL , 2014)，而采用混菌体系可以富集大
量的嗜氢产甲烷菌，提升抗冲击能力，从而提高甲烷 提纯效果。L u o 等(2012)对不同氢分压的沼气提纯进 行研究，结果表明^的注入不仅增加了嗜氢产甲烷 菌的活性，而且改变了混合菌中古菌落的结构；另 外在中温和高温条件下，古菌的落结构有差异(Luo
and  Angelidaki ，2012)。不同的实验条件会对微生物
活动产生不同的影响，对微生物组成及结构进行分析，
有助于深入了解微生物在沼气提纯过程中的变化。
4H 2+C 02=C H 4+2H 20 A G °=-130.7 KJ/mol
本研究将餐厨垃圾厌氧发酵与沼气生物提纯进 行联合实验，对厌氧发酵和沼气提纯过程的反应特 性进行分析。采用高通量测序对提纯过程中的微生 物进行研宄，分析了微生物多样性，O T U 以及微生物 组成。本研究旨在利用嗜氢产甲烷菌的代谢作用进 一步提高沼气中C H 4浓度，为厌氧发酵与沼气提纯 的联合应用提供理论依据。
1结果与分析
1.1餐厨垃圾厌氧发酵相的反应特性
1.1.1发酵过程中的气体变化
对餐厨垃圾厌氧发酵过程中的气体组分及累积
of  C H 4 can  be  effectively  increased  by  the  metabolism  of  hydrogenotrophic  methanogens . K eyw ords Anaerobic  digestion , Biogas , Biological  upgrading , Hydrogenotrophic  methanogens
0000007
6
5 4 3 2
(
0/0r s s 8 S B
O
4598基因组学与应用生物学
□乙酸
□内酸
□ r 酸
昌丨讀
■ l l 酸
Acetic Propionic Butyric Valeric Caproic acid
acid
acid
acid
acid
图2厌氧发酵过程中的VFA 变化
Figure 2 The change of VFA during anaerobic digestion
降解，因此V F A 浓度呈现先增加后下降的变化趋势。 厌氧发酵过程中挥发性脂肪酸的主要成分是乙酸和 丁酸，乙酸的最高浓度为第7天的14 981 m g /L ，而
丁酸在第5天达到最高值(1 276 m g /L )。乙酸和丁酸 浓度在整个发酵过程中呈先上升后下降的趋势，与 总V F A 的变化趋势相同，这与黄月等(2017)的研究 结果类似。
1.2沼气生物提纯相的反应特性及微生物菌变化
1.2.1气体组分变化
气体组分的变化能较直观地反映提纯效果，因 此研究了沼气提纯过程中的气体组分变化(图3)。H 2 浓度在反应前7天迅速降低到3.5%，并在之后的反 应中缓慢下降，最终氏浓度仅为0.3%，这说明氏几 乎被全部利用。由于H ，的加入使得最初的C H 4浓度
U  ^1
I
I
1 I - I - I - I - I - I™ i ™i  — I - I - I  —
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
时间(d )
Time (d )
图3沼气提纯过程中的气体组分变化
Figure 3 The change of gas content during biogas upgrading
减小，但随着嗜氢产甲烷菌的富集,C H 4浓度不断增 加，最终为96.1%，达到生物甲烷的品质；而(：02浓 度呈现不断下降的趋势，最终为1.8%。与未提纯的沼 气相比,C H 4浓度提高了 41.1%，而C 02浓度减少了 22.3%，这与林春绵等(2017)的研究结果相似：当H 2 和C 02的通气比为5：丨时，^和032几乎被全部消 耗，且C H 4浓度达到90%以上。1.2.2 H 2转化率和C h U 产率的变化
根据外源H 2的通入量和剩余量，可以计算出外 源氢气消耗量，消耗量与通入量的比值定义为外源 氢气的转化率(Omar  et  al .，2018)，公式如下：
^ =i .Qm~Q n r i )l  Q i n ^ 1 〇〇%
式中：R 为H 2的转化率，％;(^为H 2的通入量，
m L _L
H
2的输出量，m L .d
、
对提纯过程中的外源H 2转化率进行研宄发现 (表1)，反应第11天后，外源H 2转化率均高达99% 以上，高转化率意味着外源氏几乎被全部消耗，这
表明嗜氢产甲烷菌的丰度较高，
(：氏产量的增加来源 于外源H 2的加入。随着反应的进行，C H 4产率也呈不 断上升的趋势，由第5天的184.94 提高
到第27天的963.74m L *L -〜心，但后面4天C H 4产 率略有减少，最终C H 4产率为960.73 m L *L -“d '与初 始相比增加了 5倍。C f i 产率反映的是提纯过程中每 天产生的C H 4量，产生的C H 4量越多,C H 4产率越高, 表明嗜氢产甲烷菌的富集程度越高。高H 2转化率对应 较高的C H 4产率(表1)，这说明在提纯体系中，嗜氢 产甲烷菌逐渐富集，并在产甲烷过程中起主导作用。1.2.3 V F A 浓度变化
沼气提纯过程中V F A 的变化结果显示(图4)，丙 酸、丁酸、戊酸、己酸的变化较小，降解量较低。L u o 等 (2012)的研宄也表明在沼气生物提纯过程中没有明 显的丙酸和丁酸降解。而乙酸呈先上升后下降的趋
势，这可能是因为在反应初期，通入的士和(：02被 同型产乙酸菌利用生成乙酸；随着反应的进行，嗜氢 产甲烷菌逐渐富集，通入的气体被利用产生甲烷，而 体系内的乙酸也被嗜酸型产甲烷菌利用，因
此乙酸 浓度下降(Xu  et  al .，2015)。^1也1等(2017)的研究也表 明H 2能刺激同型产乙酸菌消耗氏和c o 2产生乙
酸。反应结束时的乙酸浓度为152.8 m g /L ，比最高时 降低了 40.94%。总V F A 浓度也呈现先上升后下降的 趋势，与乙酸的变化趋势相对应，最终的总V F A 浓 度为742.2 m g /L 。在沼气提纯过程中，总V F A 浓度始 终低于900 m g /L ，没有出现酸抑制现象。
{
-J /8E ) s p o B u c e oc J o j o c t u l u s  3q
h-o o o o o o
09876543
2 1(％r s c 0
3 S B
O
基于嗜氢产甲烷菌代谢的沼气异位生物提纯及其菌组成分析4599
表1沼气提纯过程中的H2转化率和CH4产率
Table 1H2 conversion rate and CH4 production rate during biogas upgrading process
时间(d)气体通入量(mL)H2输出量(m L-L'd-0H2转化率(％)CH4输入量(mL)CH4产率(mL.L—丨.(1-丨) Time (d)Gas input (mL)H2 output quantity H2 conversion CH4 input CH4 production rate
(m L.d1)rate (%)quantity (mL)(mL*L '-d1)
1
3900—一64—
590036454.5147184.94 79003595.6187373.87 99001797.9202441.84 119001298.5220497.83 13900899.0241571.81
15900799.1241647.80 17900899.0244715.80 19900599.4268798.80 21900299.8296863.78 23900399.6310914.76 25900599.4333940.76 27900499.5351963.74 29900499.5363951.73 31900399.6-960.73
E, 5" m s
兹1奮§280
260
240
220
200
180
160
140
120
•乙酸
Acetic acid
-戊故
Valericacid
-丙酸
Propionic acid
-己酸
Caproic acid
-厂酸
Butyric acid
-总V F A浓度
Total VFA content
900
800
1  3    5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
时间(d)
Time (d)
图4沼气提纯过程中的VFA变化
Figure 4 The change of VFA during biogas upgrading 较可靠。C h a o指数常用来表示物种总数，C h a o指数 在反应结束时低于前3个样本，表明提纯过程中的 古菌数量减少。S i m p s o n指数和S h a n n o n指数都是描 述微生物多样性的指数，S i m p s o n指数值越大，说明 落多样性越低，而S h a n n o n值越大，说明落多样 性越高。在提纯过程中，微生物的S i m p s o n指数增 大，S h a n n o n值减小，这表明随着反应的进行，微生物 的多样性减少，这可能是嗜氢产甲烷菌富集，同时其 他微生物减少导致的，这与前面的结果相对应：提纯 过程从第27天起,C H4浓度略有降低,014产率也有 所下降。
seifert
V e n n图用于统计多个样本中共有和独有的O-T U数目，可以比较直观地表现环境样本在不同的分 类水平上的组成相似性及重叠情况。4个样本的共享
1.2.4沼气提纯相的微生物变化
沼气生物提纯是以嗜氢产甲烷菌为主导，多种 微生物共同作用的过程。每隔10 d对提纯过程进行 取样，分别为第1天、第11天、第21天和第31天，采用高通量测序对提纯过程中的古菌进行测定，分 析了微生物的多样性、O T U和落组成变化。
研宄了4个样本的微生物多样性指数，包括覆 盖率、C h a o指数、S i m p s o n指数以及S h a n n o n指数 (表2)。4个样本的覆盖率都极高，这说明了测试结果表2沼气提纯过程中第1天，第11天，第21天和第31天样 本的微生物多样性指数
Table 2 Microbial diversity indices for the samples of day 1,11, 21 and 31 during biogas upgrading process
时间(d)覆盖率Chao指数Simpson 指数Shannon 指数Time (d) Coverage Chao index Simpson index Shannon index 10.999 916140.322  1.321
110.999 976140.391  1.216
210.999 957140.409  1.107
310.999 971130.416  1.064
4600基因组学与应用生物学
liii Euryxirchaeota  Q  Methanosaeta
^ Meihanomassiliicoccales
Unclassified
时间(d>
Time (d)
图6沼气提纯过程中第1天，
第11天，第21天和第31天样 本的微生物属水平的相对丰度
Figure 6 Relative abundance of microbial community for the samples of day 1, 11, 21 and 31 at the genus level during biogas upgrading process
al .，2005)。根据对古菌属水平的分析，发现在提纯过
程中嗜氢产甲烷菌选择性富集，成为产甲烷的主要
菌种，这与13355311丨等(2015)的研究结果相同。
2讨论
沼气是一种能源物质，主要用来发电和供热，若 能提升沼气的热值，则能大大提高沼气的利用方式。 沼气中存在大量c o 2，利用嗜氢产甲烷菌的代谢作 用将C 02转化为C H 4是近年来沼气提纯的研宄热 点。目前，对模拟沼气(Xu  etal .，2015)和实际沼气
(Bassani  et  al .，2015)的生物提纯都进行了深入研宄，
但实际沼气中存在N 2、H 2S 等微量气体，可能会对提 纯效果产生一定影响，所以模拟沼气不能真实地反 应提纯效果，因此本实验将厌氧发酵与沼气异位生 物提纯进行联合，旨在进一步提高C H 4浓度。
本实验 分为两个阶段，首先是餐厨垃圾的厌氧发酵。厌氧发 酵结束时C H 4浓度为54.7%，C C V 浓度为24.1%。然 后利用嗜氢产甲烷菌的代谢对产生的沼气进行生物 提纯，经过提纯,C H 4浓度提高到96.1%，H 2几乎被 全部用于生成甲烷，最终的c o 2浓度也较低，己达到 生物甲烷的品质。Bassani 等(2015)在中温条件下对 沼气进行异位提纯，最终C H 4浓度为88.9%;Y u n 等 (2017)在不同温度(中温和高温)条件下进行沼气的生 物提纯，中温条件下的最终甲烷浓度为90%，这两个 研究在中温条件下获得的C H ，浓度都低于本实验获 得的结果。
O T U 达到66.7%，表明古菌组成没有发生较大的变
化。但反应初始和结束时的差异较大，为22.2%，这是 因为反应初始时的微生物多样性高于反应结束时。 提纯过程中的微生物组成是逐渐变化的，这可能是 因为H 2和c o 2的通入逐渐富集了嗜氢产甲烷菌，导 致其他微生物不断减少(图5)。
为了进一步研究提纯过程中的微生物代谢，分 别对提纯第1天、第1丨天、第2丨天和第3丨天样本 中的古菌进行属水平的分析(图6)。反应初始，体系 中嗜酸型和嗜氢型产甲烷菌均存在，其中嗜酸型
和嗜氛型 Met /io /iocu //ez « 的相对丰度
最闻，分别为26.5%和22.6%。此夕卜，1^/«1?1〇>5(1/_(：^1«、
Euryarchaeota^Methanobacterium Methanomassiliic- 的相对丰度分别为18.1%、16.5%、10.7%和 4.1%，与之前的结论相对应(表2)，反应初始时的微 生物多样性最商。随着反应的进行，Mei /iareoc !J /ei « 和的相对丰度逐渐增力P ，在反应结 束时达到43.7%和34.2%，而这两种菌都属于嗜氢产
甲’院菌(Karakashev  et  al .，2005)，这说明在提纯过程 中选择性富集了嗜氢产甲烷菌。反应结束时 的相对丰度减少到 7.5%。M e «/m w w a -
r C ^a 既是嗜酸型产甲烷菌，也是嗜氢型产甲烷菌，底
物的改变使其产甲烷方式也发生了改变，相对丰度 没有进一步降低(Yun  et  al .，2017)。嗜酸型产甲烷菌
Me ■也wifwoeta 的相对丰度卜降最多，可能是因为缺乏
足够的底物生成甲焼。£W _y or (‘/i .a «oto 是一■种中温的 古菌，相对丰度的减少可能是因为嗜氢产甲烷菌的 虽集压缩了其生存空间。Mef /m n o m a m 7iicoccaZe .s 的 相对丰度较小，并且在反应前后变化不大，因为它是 一种基于H 2的甲基营养型产甲烧菌(Karakashev  et
21
II
图5沼气提纯过程中第丨天，第11天，第21天和第31天样 本的OTU
Figure 5 OTU for the samples of day 1, 11,21 and 31 during bio­gas upgrading process
j..a
5
mm
m
m
/l (
I I I
A /e A /t f A /c 0圍i i k
00
90807060
50403020
10(％) auUBPUnq
c o 0>>l
B I 3
Q i (。/0)
钯卅友
s

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。