牛源鲍曼不动杆菌的鉴定及体外药敏试验
王孝武;王旭荣;李建喜;王学智;林杰;杨志强
【摘 要】为鉴定山西省某奶牛场引起奶牛子宫内膜炎的相关病原菌.采用细菌分离培养、革兰染镜检和16S rDNA测序分析法对采集的奶牛子宫分泌物进行细菌鉴定;通过体外药敏试验和小鼠致病性试验检测其耐药性和致病性,并与已知序列进行比对,了解其亲缘性.结果显示,共分离到1株鲍曼不动杆菌,该株菌与中国内地和美国的分离菌株属于同一分支,且与美国的分离菌株亲缘较近;该菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、红霉素、先锋霉素Ⅳ均耐药;对小白鼠有较强的致病性.
【期刊名称】《西北农业学报》
【年(卷),期】2015(024)005
【总页数】5页(P13-17)
【关键词】鲍曼不动杆菌;子宫内膜炎;奶牛
【作 者】王孝武;王旭荣;李建喜;王学智;林杰;杨志强
【作者单位】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州 730050
【正文语种】中 文
【中图分类】S857.2+3
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是一种革兰阴性球杆菌、短棒状，稳定期呈球状，属于奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)不动杆菌属(Acinetobacter)。鲍曼不动杆菌在人和动物
是条件致病菌，能引起伤口感染、尿路感染、脑膜炎、败血症等疾病。由于鲍曼不动杆菌能够抵御高温，形成生物膜并获得对抗生素的耐药性，在医院和兽医学校等环境中分布广泛[1-3]。近年来，因临床上广泛使用抗生素鲍曼不动杆菌，使得该菌的多重耐药性不断增加，成为国内外关注的重点之一[4-7]。鲍曼不动杆菌不仅可致新生驹的败血症、牛乳腺炎、水牛流产、鳜败血症，还能引起仔猪腹泻[8-10]。国内曾报道，该菌可引起银鲫、斑点叉尾鮰爆发疾病，且死亡率极高[11-12]。国外有研究显示，可从牛奶中分离到鲍曼不动杆菌，但尚无与子宫内膜炎相关的报道。本研究从患有子宫内膜炎奶牛的子宫分泌物样品中分离到1株多重耐药的鲍曼不动杆菌，并进行耐药性和攻毒试验研究，以期为临床防治该菌提供一定参考。
1.1 材 料
1.1.1 菌株来源 2013年10月，在山西省某奶牛场对患有子宫内膜炎的奶牛进行病原菌分离鉴定时，从患病奶牛的子宫分泌物样中分离获得。
1.1.2 主要试剂及试验动物 营养肉汤、血琼脂基础培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司，水解酪蛋白琼脂(MH)购自杭州微生物试剂有限公司，16S rDNA Bacterial Identificati
on PCR Kit 购自宝生物工程(大连)有限公司，细菌总DNA提取试剂盒为OMEGA生物科技有限公司的Bacterial DNA Kit。
清洁级昆明小白鼠12只，体质量18～22 g，购自兰州大学实验动物中心。
1.1.3 药敏纸片 共15种药敏纸片，包括四环素(每片30 μg)、氟苯尼考(每片30 μg)、氧氟沙星/奥复星(每片5 μg)、卡那霉素(每片30 μg)、红霉素(每片15 μg)、青霉素(每片10 U)、庆大霉素(每片10 μg)、恩诺沙星(每片5 U)、诺氟沙星(每片10 μg)、阿莫西林/棒酸(每片20 μg)、氨苄西林(每片10 μg)、头孢噻肟(每片30 μg)、复方新诺明(磺胺甲噁唑/甲氧苄啶，每片19 μg)、链霉素(每片10 μg)、头孢氨苄/先锋霉素Ⅳ(每片30 μg)，药敏片直径6 mm，均均购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2 方 法
1.2.1 细菌的分离 将采集的子宫分泌物样品无菌操作接种于鲜血琼脂平板，分别进行厌氧培养和有氧培养。根据菌落形态、菌体形态和染特性初步判定为细菌类属，将典型菌落进行二次纯化培养18～24 h后进行镜检观察。若细菌纯净则接种于营养肉汤进行增殖培养，以备做相关鉴定项目。
1.2.2 细菌DNA提取 按照DNA提取试剂盒的操作说明提取营养肉汤中细菌的DNA，并将该DNA作为PCR扩增模板。
1.2.3 16S rDNA 鉴定 通过16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit中的正向引物和反向引物扩增16S rDNA片段，并进行10 g/L凝胶琼脂电泳试验。目的片段送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。所得序列通过GenBank的在线BLAST软件搜索比对，确定细菌种属。
1.2.4 16S rDNA 序列比对分析 通过GenBank数据库获取基因序列，并将同源性较高的序列作为比对序列(表1)，采用MEGA软件对测序结果进行序列比对分析。
1.2.5 生化试验鉴定细菌 将分离菌接种于鲜血琼脂平板，分别在37、42、44和50 ℃进行有氧培养，并将分离菌纯培养物进行糖发酵试验。
1.2.6 药敏试验 按美国CLSI(美国临床实验标准委员会标准)的指导采用纸片扩散法(K-B法)对分离菌进行药敏试验[13]。
1.2.7 动物致病性试验 取12只清洁级昆明小白鼠，随机平均分成A、B、C组。A和B组为试
验组、C组为对照组。细菌分离株接种至营养肉汤，37 ℃培养18 h，调整细菌数约为5.0×108 cfu/mL，并配制稀释10倍的菌液。A组小白鼠腹腔注射肉汤培养物0.2 mL，B组小白鼠腹腔注射10倍稀释菌液0.2 mL，C 组小白鼠注射等量生理盐水，72 h内定时观察小白鼠的活动情况。
2.1 16S rDNA鉴定结果
以该菌的DNA为模板，通过16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒扩增16S rDNA片段，获得预期片段500 bp左右(图1)，回收PCR产物后，在GenBank数据库进行BLAST搜索比对。结果显示，分离菌与鲍曼不动杆菌(HQ631961.1)16S rDNA的同源性达99%。
将该分离菌株的16S rDNA序列与比对序列进行比对分析。结果显示，该株鲍曼不动杆菌与中国内地和美国的分离菌株属于同一分支(图2)，且与美国的分离菌株亲缘关系较近，与台湾的分离菌株分属不同分支，亲缘关系较远。
2.2 特异生化鉴定结果
分离菌株在37、42和44 ℃生长良好，但在50 ℃不生长。分离株的特异性生化试验结果见
表2，结果显示，乳糖、蔗糖、葡萄糖以及麦芽糖均呈阳性，木糖、半乳糖、D-果糖、L-阿拉伯糖以及VP、MR、O/F均为阴性，与公开报道相符[9]。说明，该菌为不动杆菌属内的鲍曼不动杆菌，与测序比对结果一致。
2.3 药敏试验结果
药敏试验结果[10]显示，该菌对诺氟沙星、恩诺沙星、奥复星、氟苯尼考、头孢噻肟、复方新诺明敏感，对四环素中度敏感，对其他抗生素均耐药，尤其是对氨苄西林和青霉素等的耐药性较强(表3)。
2.4 动物致病性试验结果
分别给A、B组小白鼠腹腔注射0.2 mL原菌液和稀释液，12 h后，小白鼠精神萎靡、食欲不振。24 h后，试验组A组的小白鼠全部死亡，B组小白鼠精神萎靡，对照组C组小白鼠正常。
不动杆菌易在普通培养基上生长，但生化反应表现出相对惰性，影响不动杆菌的鉴定与分型。陆文浩等[11]和Towner等[14]采用API20NE系统方法对不动杆菌进行鉴定和分型。本研
究通过16S rDNA细菌鉴定法也能准确鉴定出该菌。
大量研究表明，鲍曼不动杆菌具有广泛的耐药机制，且获取新的耐药性能力很强[15]。一些鲍曼不动杆菌具有含多重耐药基因的大型基因岛，并且穿插着转座子、整合子等基因。本试验分离出的鲍曼不动杆菌对氨苄西林等耐药，属于多重耐药[16]。青霉素、氨苄西林、阿莫西林属于β-内酰胺类抗生素，由于β-内酰胺水解，导致鲍曼不动杆菌对其耐药性较强。链霉素和庆大霉素属于氨基糖苷类抗生素，可能由于氨基糖苷类修饰酶和16S rDNA甲基的改变导致耐药，说明该株鲍曼不动杆菌可能存在AacC1/2、AadA、AadB、Ant1、AphA1、AphA6、ArmA等耐药基因中的一种或多种。先锋霉素Ⅳ属于头孢类抗生素，其耐药的原因可能与β-内酰胺水解有关，说明该株鲍曼不动杆菌可能含有ADC1、ADC2、ADC3、ADC4、ADC5、ADC6、ADC7、VEB-1、VEB-2、PER-1、PER-2、TEM-92、TEM-116、SHV-12、SHV-5、CTX-M-2、CTX-M-3、OXA-51-like等耐药基因中的一种或多种[17-18]。卡那霉素是一种蛋白质生物合成抑制剂，该菌对其耐药可能是该菌产生了一种可以破坏卡那霉素的酶。
随着抗生素的大量使用，鲍曼不动杆菌的耐药性逐渐增强。目前，对鲍曼不动杆菌的杀菌
剂中，多粘菌素E被视为唯一可用的体外活性抗菌剂[19]。粘菌素与利福平、米诺环素、头孢他啶、亚胺培南、阿奇霉素等对多药耐药鲍曼不动杆菌体外协同使用，效果更佳[20-21]。
本研究分离获得的鲍曼不动杆菌值得引起重视，由于该菌属于条件致病菌且耐药性越来越强，因此，需对该菌的致病机制进行深入研究。
Reference (参考文献)：
[1] Jawad A,Seifert H,Snelling A M,et al.Survival of Acinetobacter baumannii on dry surfaces:comparison of outbreak and sporadic isolates [J].Journal of Clinical Microbiology,1998,36(7):1938-1941.
[2] Boerlin P,Eugster S,Gaschen F R,et al.Transmission of opportunistic pathogens in a veterinary teaching hospital [J].Veterinary Microbiology,2001,82(4):347-359.
[3] Gaddy J A,Actis L A.Regulation of Acinetobacter baumannii biofilm formation [J].Future Microbiology,2009,4(3):273-278.
[4] Munoz-Price L S,Weinstein R A.Current concepts:Acinetobacter infection [J].New England Journal of Medicine,2008,358(12):1271-1281.

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