January 2021Vol.41 No.1
2021 年 1 月 第 41 卷 第 1 期
基础医学与临床Basic & Clinical Medicine
文章编号：1001-6325 ( 2021 ) 01-0087-06
研究论文
大动脉炎患者外周血单个核细胞RT-qPCR 内参基因的选择
田苡箫，李菁*
收稿日期：2019-11-18 修回日期：2020-04-30
*
通信作者(corresponding author ) ：lijing6515@ pumch
（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院风湿免疫科风湿免疫病学教育部重点实验室
国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心，北京100032）
扌摘要：目的筛选适于在大动脉炎（TAK ）患者和健康人（HC ）之间比较外周血单个核细胞（PBMC ）中mRNA 表达
水平的内参基因。方法提取PBMC 中的总RNA，应用RT-qPCR ，分别采用geNorm 、NormFinder 、BestKeeper 3种软 件程序，分析 3-glucuronidase ,GAPDH ,ACTB ,SDHA ,HPRT1,RPL13A ,B2M , YWHAZ 和 PKG1 9 个基因的 mRNA 表达
稳定性。以T-bet 、GATA3和RORC 作为目的基因，比较不同稳定性的内参基因对mRNA 相对丰度的影响。结果
geNorm 筛选得到的基因组合为B 2M-SDHA , Nor^nFinder 和BestKeeper 筛选出最稳定的内参基因均为HPRT1 ； 3种方
法均显示GAPDH 的稳定性较差。结论自身免疫病患者在接受免疫抑制药物时，原本稳定表达的基因可能会 上调或下调；在样本量较小时，稳定性更好的内参基因可能更有助于检测组间差异。
关键词：大动脉炎；实时定量聚合酶链式反应;RNA 稳定性；内参基因选择
中图分类号:R593.2 文献标志码:A
Validation of reference genes for the normalization of the RT-qPCR
in peripheral blood mononuclear cells of patients with Takayasu arteritis
TIAN Yi-xiao ， LI Jing *
(Department of Rheumatology and Immunology , Key Laboratory of Rheumatology and Clinical Immunology , Ministry of Education ,
National Clinical Research Center for Dermatologic and Immunologic Diseases ( NCRC-DID ),
Peking Union Medical College Hospital , CAMS & PUMC , Beijing 100032, China)
Abstract ： Objective To validate proper reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction ( RT-
qPCR) used for comparing mRNA expression levels in Takayasu arteritis" (TAK) and healthy controls' ( HC ) pe
ripheral blood mononuclear cells ( PBMC ). Methods Total RNA in PBMCs was extracted and
used RT-qPCR to determine the profiles of 9 candidate genes , including 0-glucuronidase, GAPDH , ACTB , SDHA , HPRT1, RPL13A , B2M , YWHAZ and PKG1. Then compared their transcription stability by geNorm , NormFinder , and Best
Keeper. Afterwards , with T-bet , GATA3 and RORC as the targeted genes , explored the influence of reference genes with different stability on mRNA relative abundance. Results The gene combination of B2M-SDHA was selected by
geNorm , and HPRT1 was the most stable one in analysis results of NormFinder and BestKeeper , while GAPDH was less stable. Conclusions Genes that have been expressed stably may be upregulated or downregulated when
patients with autoimmune diseases received immunosuppressive drugs. When the sample size is small ， the more sta ble internal reference may facilitate the identification of inter-groups difference.
Key words : Takayasu arteritis ； real-time polymerase chain reaction ； RNA stability ； selection of reference gene
88基础医学与临床Basic&Clinical Medicine2021.41(1)
反转录实时荧光定量聚合酶链式反应（reverse quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）是目前分析基因表达水平的黄金标准，却经常表现出重复性欠佳的问题，选取合适的内参基因有助于改善这一情况［1］。大动脉炎（Takayasu arteritis,TAK）是以主动脉及其一级分支受累为主，表现为非特异性慢性肉芽肿性血管炎的系统性疾病。糖皮质激素、免疫抑制剂是TAK的常用药物，这二者均可能导致TAK患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中管家基因表达水平的改变。在用相对定量qPCR分析TAK 患者与健康对照（healthy control,HC）人的基因表达差异时，合适的内参基因有利于得到更稳定、更准确、组间差异更小的结果［1］o
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂：人淋巴细胞分离液（深圳市达科为生物工程有限公司）；Trizol Reagent（Ambion公司）; TaKaRa RR047A、引物（苏州金唯智生物科技有限公司，纯化方式为PAGE-Plus）；Easy dilution （TaKaRa9160）、iTaq TM Universal SYBR®Green Supermix（Bio-Rad公司）。
1.1.2外周血样本：2019年4月至2019年6月于北京协和医院风湿免疫科门诊纳入TAK患者18例，均符合美国风湿病协会1990年的诊断标准⑵，采用1994年NIH标准评估疾病活动性［3］，纳入健康对照9人。样本的采集和使用经过北京协和医院伦理委员会的批准（S-478），受试者均签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1PBMC的分离、RNA的提取和反转录：用无热原的采血针和真空乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管（Becton Dickinson公司）采集肘部静脉血，常温放置,8h内用密度梯度离心法分离PBMC。用Trizol 法从PBMC中提取总RNA，紫外分光光度法检测RNA的浓度和纯度，取俎。/血0在1-8~2.1、琼脂糖凝胶电泳可见28S和18S条带清晰无弥散、28S条带亮度约为18S条带亮度2倍的样本，除去基因组DNA（gDNA）之后进行反转录。
1.2.2内参基因的选择和引物的检测：9个候选基因的相关信息见“2.3引物的扩增效率、线性范围和特异性"。以Cq值为纵坐标、以初始模板量的log 值为横坐标绘制标准曲线，计算回归系数和扩增效率［扩增效率=（10-1/斜率-1）X100%］，确定线性范围。
1.2.3内参基因的稳定性分析：用geNorm A Norm-Finder、BestKeeper3种程序分别对各组［混合组（mixed group,TAK患者+健康对照）、健康对照组（healthy control,HC）、TAK组］候选内参基因的稳定性进行排序，对内参基因进行筛选。
1.2.4分析结果的检验：以geNorm筛选出的mixed group的基因组合为内参，计算各组（HC组、TAK 组、活动性TAK组、非活动性TAK组）PBMC中候选内参基因mRNA的相对含量，并比较组间差异。
以T-bet、GATA3和RORC为目的基因，分别以稳定性不同的基因为内参，分析目的基因mRNA的组间差异，并与文献报道作比较。
1.3统计学分析
计量变量米用Kolmogorov-Smirnov进行正态分布检验，符合正态分布时用平均值土标准差（"士S）表示，不符合时用中位数［M（0,⑦）］表示。组间比较采用Mann-Whitney U检验，分析软件为Graphpad Prism7.0。
2结果
2.1TAK患者的实验室参数和临床特征
TAK患者的实验室参数和临床特征见表1。健康对照组（HC）纳入9人（1名男性,8名女性）。
2.2RNA样本的纯度与完整性
RNA样本的A260/A280均在1-8~2.1,A230不低于1.7，琼脂糖凝胶电泳可见电泳可见28S、18S条带清晰无弥散,28S条带亮度约为18S条带亮度的2倍。
2.3引物的扩增效率、线性范围和特异性
引物的序列、扩增效率、线性范围、标准曲线等信息见表2。融解曲线均为单峰。
2.4基因表达的稳定性分析
用geNorm⑷、NormFinder⑸、BestKeeper［6］这3种计算方法对9个基因的表达稳定性的分析结果如所示。用geNorm分析时，混合组PBMC的各候选内参基因的M值均小于1.5，稳定性为GAPDH（0.419）
田苡箫 大动脉炎患者外周血单个核细胞RT-qPCR 内参基因的选择89
表1入组TAK 患者的实验室参数和临床特征
ESR. erythrocyte sedimentation rate ； hs-CRP. high-sensitivity C-reactive protein ； IL-6. interleukin 6 ； TN F. tumor necrosis factor.
Table 1
Laboratory parameters and clinical features of patients with TAK [x ±s , M ( Q 】,23)]
group
TAK( n =18)active TAK( n = 10)
non-active TAK( n =8)P value
age/year 38. 8±9.438. 1±7.439. 7±11.2
0. 94
gender ( male/female )0 / 180 / 10
0 / 8-disease duration/months 40(12,88)
88( 14.5,132. 75)37( 10.25,45)
0. 17ESR/( mm/h )
14. 61±9.4116. 90±11. 3411.75±4. 870. 42hs-CRP/(mg/L)1(0.55,5.4) 5.4(0. 77,7. 8)0. 88(0.41,1.47)
0. 06IL-6/ (pg/mL)
2. 1(2,4.4)
3.5(2. 1,5.8)
2(2,2. 25)
0. 03TNF/(pg/mL)7. 79±4. 598. 73±5. 79 6. 73±2. 21
0. 62
prednisone
use /non-use 17 / 110 /07 / 1-doze /( mg / d)
10(10,35)12.5(10,21.25)
7.5(6. 25,22.5)
0. 30
表2 RT-qPCR 引物相关信息
Table 2 Details of the primers used for RT-qPCR
gene
NCBI reference sequence length / bp primer sequence( 5/-3/)E / %R 2
linear dynamic
range
Tm/弋GAPDW
NC_000012. 12
143
F:GCACCGTCAAGGCTGAGAAC R:ATGGTGGTGAAGACGCCAGT
1.06
0. 998918. 85~34. 87
83.0
ACTS NC_000007. 14181F:CCACCATGTACCCTGGCATT R:ACTCCTGCTTGCTGATCCAC
0. 950. 9976
18.90-36. 6283.9
R-glucuronidase
NC_000007. 14
121
F:GACACGCTAGAGCATGAGGG R:GGGTGAGTGTGTTGTTGATGG
0. 900. 993725.37-36. 1985.2
SDWA
NC_000005. 1094F:CAGCATGTGTTACCAAGCTGT R: GGTGTCGTAGAAATGCCACCT
0. 860. 997022. 78~34. 3780.9
WPRT/NC_000023. 1175F:TTTATTCCTCATGGACTAATTATGGA R:CCTCCCATCTCCTTCATCAC
0.910. 998223.59~30. 8775.5
RPL75A
NC_000019118F:AAAAGCGGATGGTGGTTCCT R:GCTGTCACTGCCTGGTACTT
0. 930. 995417.09~35. 8183.9
S2胚
NC_000015. 10248F:GAGGCTATCCAGCGTACTCCA R:CGGCAGGCATACTCATCTTTT
0. 890. 997416. 61~35. 2079.3
F^WAZ NC_000008. 11123F:AGACGGAAGGTGCTGAGAAA R:CGTTGGGGATCAAGAACTTT
1.010. 999020. 60~34. 1377.2
PKG/NC_000023. 11152F:TGGACGTTAAAGGGAAGCGG R:GCTCATAAGGACTACCGACTTGG
0. 880. 995619. 68~30. 9380.9
T-bet NC_000017. 11170F:TGACCCAGATGATTGTGCTCCAGT R:AATCTCGGCATTCTGGTAGGCAGT
1.040. 98092
2. 25~32. 3582.9
GATA5
NC_000010. 11115F:CACCACAACCACACTCTG R:GCCTTCCTTCTTCATAGTCA
0. 880. 982023.66~35. 9579.7
RORC
NC_000001. 11156F:GTGGGGACAAGTCGTCTGG R:AGTGCTGGCATCGGTTTCG
1. 170. 996621.47~3
2. 5386.4
GAPDH . glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ； ACTS . R-actin ； SD^A . succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A ； HPRTV . hypoxanthine
phosphoribosyl transferase 1 ； 尺P 厶75A . ribosomal protein L13a ； beta-2-microglobulin ； F^WAZ . tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5；
PKG/, phosphoglycerate kinase 1 ； T-bet . T-box transcription factor 21 ；GATA3. GATA binding protein 3 ；尺ORC . RAR related orphan receptor C ； the first
nine genes were candidate genes , and the last three were target genes.
90基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine 2021.41(1)
<RPL13A ( 0. 400) < P-glucuronidase ( 0. 384) <ACTB
(0. 367) <PGK1 (0. 354) < YWHAZ (0. 337) <HPRT1
(0.307) <B2M (0. 300) = SDHA (0. 300)(括号中为 M 值)(表3)，又因为配对变异值V2/3 = 0. 091< 0. 15，因此最佳内参基因组合数目为2，为M 值最小
的2个基因B 2M 和SDHA 的组合。同理，TAK 组
PBMC 的最佳内参为ACTB 和GAPDH 的组合，对照
组PBMC 的最佳内参为PKG1和YWHAZ 的组合(图 1)。用NormFinder 分析时，混合组PBMC 的最稳定
基因是HPRT1, TAK 组PBMC 的最稳定基因是 HPRT1,HC 组PBMC 的最稳定基因是GAPDH 。用 BestKeeper 分析时，各基因CP 值的标准差均小于1 (说明各基因均合格)，混合组PBMC 以及TAK 组
PBMC 的最稳定基因均为HPRT1, HC 组PBMC 的
最稳定性基因为GAPDH 。此外,NormFinder 显示,
在9个基因之中，GAPDH 的组间变异最大(±0. 177)
RT-qPCR normalization in different panels
图1 geNorm 计算的成对变异Vn/n+1值
Fig 1 Pairwise variation (Vn/n+1) calculated by geNorm
表3按照geNorm x NormFinder 或BestKeeper 的计算结果对候选基因稳定性排序
Table 3 Reference genes were ranked in order of their stability calculated by geNorm , NormFinder or BestKeeper
group
mix group
TAK group
healthy group
geNorm
NormFinder
BestKeeper
geNorm NormFinder
BestKeeper geNorm NormFinder
BestKeeper rank gene gene
gene
gene gene
gene gene
gene gene M value
stability CV M value stability CV M value
stability
CV
value [% CP]value
[% CP]
value [% CP]1B 2M HPRT 1HPRT 1
ACTB
HPRT 1HPRT 1PGK 1GAPDH
GAPDH
0.3
0. 071 1.120.2490.132 1.24
0.126
0. 0690.72
SDHA ACTB
|3-glucuronidase
GAPDH SDHA |3-glucuroni d as e YWHAZ B2M |3-glucuronidase
0.3
0. 09 1. 19
0. 249
0. 191 1.360. 126
0. 092
0. 82
3HPRT1YWHAZ YWHAZ |3-glucuronidase
YWHA
YWHAZ
B2M YWHAZ HPRT10. 307
0. 09 1.44
0. 33
0. 197 1.660. 1650. 108
0. 84
4YWHAZ PGK1RPL13A PGK1PGK1RPL13A
ACTB
ACTB RPL13A 0. 3370. 105
1.46
0. 343
0. 203
1.720. 187
0. 117
reference group0.95PGK1B2M PGK1HPRT1ACTB SDHA GAPDH HPRT1ACTB
0. 3540. 113
1.670. 369
0. 216
1. 860. 196
0. 118
0. 99
6ACTB |3-glucuronidase
SDHA YWHAZ |3-glucuronidase
PGK1
SDHA PGK1YWHAZ 0. 3680. 129
1.70.3860. 221
1.940. 209
0. 121
0. 997|3-glucuronidase
GAPDH GAPDH
SDHA B2M GAPDH
HPRT1RPL13A
PGK10. 383
0. 135
1. 970. 403
0. 2222 040. 220. 131 1. 07
S RPL13A SDHA ACTB B2M GAPDH ACTB RPL13A
SDHA SDHA
0.40. 144
2. 04
0.4160. 254
2. 49
0. 2290. 143
1. 129GAPDH RPL13A B2M RPL13A RPL13A B2M |3-glucuronidase 0-glucuronidase
B2M 0.4190. 149
2. 16
0. 441
0. 316
2. 66
0. 2520. 204
1.23
CV. the coefficient of variance expressed as a percentage on the cross points
level.
田苡箫大动脉炎患者外周血单个核细胞RT-qPCR内参基因的选择91 2.50~□control■TAK□active TAK口nonactive TAK
u
-2s u J d x u u A -a£9 J
00
2
•
50
1
±
00
1
±
•
50
*
***-i-
t.
ACTB B2M GAPDH ACTB
YWHAZ
SDHA
RPL13A
PGK1
HPBT1
GAPDH
B2M
p-glucuronidase
T
A H
-0.400-0.20000.200
B
PGK1
A
HPBT1
u
-2s u
J d x u
u
A
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9
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u
-2s u
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H
工
匸2
t
u
-2s u
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9
J
工
t
L
°
RPL13A SDHA
GATA3
u
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u
A
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9
J
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9
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C
YWHAZ p-glucuronidase
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A.histogram of the expression levels of9candidate reference genes in4panels,normalized to the geometric mean of Cq value of B2M and SDHA；
B.intra-group variation and inter-group variation of candidate reference genes calculated by NormFinder；
C.the relative expression levels of3target genes(T-bet,GATA3and RORC)in4panels,respectively normalized to the geometric mean of Cq value of B2M and SDHA,HPRT1and GAPDH；TAK.takayasu a
rteritis,n=18；con-trol.healthy control,n=9;active TAK,n=10；nonactive TAK,n=8；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001compared with control；*P<0.05，牌P<0.01compared with nonactive TAK
图2内参基因的表达稳定性对相对定量的影响
Fig2Effect of stability of reference gene expression on relative quantification
（图2B）。以B2M-SDHA组合为内参，比较9个基因的mRNA含量的组间差异，结果显示，TAK组PBMC中GAPDH（P<0.01）,ACTB（P<0.05）、0-glucuronidase（P<0.05）的mRNA的含量显著高于HC组（图2A）。
分别以B2M-SDHA组合（geNorm所筛选）、HPRT1（NormFinder和BestKeeper所筛选）以及GAPDH（3种方法均显示稳定性略低的基因）为内参，比较TAK组、对照组、活动组、非活动组的PBMC中T-bet^GATA3和RORC的mRNA含量（图2C）
。
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