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番茄SlWRKY40基因VIGS表达载体构建及其沉默效率检验
刘波
【摘 要】WRKY蛋白伴随植物适应环境的过程进化而来,具有重要调节作用.番茄中存在大量WRKY基因,其功能研究却严重滞后.本实验体外扩增了番茄SlWRKY40基因,构建了pTRV-SlWRKY40病毒诱导的基因沉默表达栽体,实时定量PCR法检测了SlWRKY40在番茄中的沉默效率.结果表明该基因的沉默效率平均可以达到60％以上,单株最高可达80％左右.本实验中的工作为我们今后研究SlWRKY40的生物学功能做了必要的前期准备,同时为研究番茄WRKY家族其他成员的功能提供了技术支撑.
【期刊名称】《陕西农业科学》
【年(卷),期】2018(064)002
【总页数】5页(P23-27)
【关键词】番茄;SlWRKY40;转录因子;VIGS;沉默效率
【作 者】刘波
【作者单位】渭南职业技术学院,陕西渭南714026
【正文语种】中 文
病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术根据植物抵抗病毒的原理发展而来，因为具有短时间获得实验结果、不需要遗传转化、能够研究在转基因植株中致死的基因的功能等优点，已经被普遍应用于植物基因功能研究[1～3〗。
WRKY 蛋白由于独特的结构特征构成一个植物转录因子大家族[4～7]，并以特有的功能方式调控植物生理过程[4, 8～17]。研究WRKY基因的功能对我们认识植物进而更好地改造和应用植物资源具有重要的现实意义。番茄进化过程中形成了至少八十个WRKY基因[18]，急需对其功能展开研究。由于其体系成熟和高效性，许多科研团队都采用由烟草脆裂病毒(TRV)改造而成的VIGS载体研究植物的基因功能。我们从番茄中克隆了一个具有WRKY结构域的基因，将其命名为SlWRKY40。为了后期探究其生物学功能，我们构建了SlWRKY40基于TRV的VIGS沉默表达载体——pTRV-SlWRKY40，同时检验了其沉默效率。
结果表明该基因的沉默效率平均可以达到60%以上，单株最高可达80%左右。本实验中的工作为我们今后研究SlWRKY40的生物学功能做了必要的前期准备，同时为研究番茄WRKY家族其他成员的功能提供了技术支撑。
1 材料与方法
1.1 植物材料与培养
本实验所用番茄(Lycopersicum esculentum)品种为苏红2003(杂交一代)，由江苏省农业科学院研制。
将番茄种子均匀撒布于湿润滤纸上，25℃培养2～3 d，生根后转移至装有混合基质(蛭石、泥炭土、珍珠岩体积比6∶2∶1)的盆中，温室培养，定期施肥。室内温度22～23℃，日光灯做光源，光照强度约为30 000 勒克斯，光照周期为16 h·8 h，相对湿度为50%～55%。
1.2 基因克隆及序列验证
用Trizol法提取4周龄番茄叶片的总RNA。
以总RNA为模板反转录合成cDNA。
根据SlWRKY40基因(NCBI登录号：NM_001316915)全长序列设计引物，上下游引物分别为：SlWRKY40-1F(ATGGAGTTCACAAG TTTAGTTGATAC)和SlWRKY40-1R(GACATGTCCTAGTGGCTGCCTGTCT)，以cDNA为模板，扩增其全长序列。
使用Primerstar DNA聚合酶(Takara)进行PCR克隆基因。PCR反应总体积25 μL，反应条件：92℃变性2 min ；92℃变性20 s、退火1 min 20 s和72℃延伸1 min 10 s，循环35次，72℃延伸10 min。
PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA Gel Purification Kit(Axygen,USA)回收目的条带，并连接T/A克隆载体pMD19-T vector，42℃热击转化大肠杆菌(E. coli JM109)。蓝白斑筛选和菌落PCR验证后挑取阳性克隆送南京金思特科技有限公司测序。
1.3 基于TRV的VIGS载体构建及农杆菌转化
根据基因序列，选取保守区域以外的477 bp片段设计引物，在引物两端设计合适的内切酶酶切位点序列，以便后续操作。上下游引物分别为：SlWRKY40 -vigs-1F (GCG TCTAGA
CCAATCGATTCTAGTAGCAACI)和SlWRKY40-vigs -1R (ATA CTCGAG GACATGTCCTAGTGGCTGCCT)
以测序验证正确的SlWRKY40质粒为模板，用上下游引物进行PCR扩增目的基因片段。
PCR方法同上。利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，割胶回收。回收的PCR产物及pTRV2表达载体一起用相应的内切酶进行双酶切，酶切反应体系为25 微升，各种内切酶及缓冲液用量根据相应生产厂家建议决定，37℃水浴4～6 h。用AxyPrep PCR Clean-up Kit(Axygen公司)纯化并回收酶切产物。连接反应体系为目的片段DNA 4 μL、载体DNA 1μL、sulution I 5 μL，4℃连接过夜。连接产物(即pTRV2-SlWRKY40)转化大肠杆菌(JM109)，选择单菌落扩大培养并用菌落PCR验证，用阳性克隆对应的菌液提取质粒，并用相应的内切酶酶切鉴定。
用电击转化法将上述酶切鉴定无误的质粒导入农杆菌(GV3101)菌株中。电击仪GENE PULSER II Electroporation System(Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)设置为电流25 μF，电阻无穷大，电压2.5 kV，电击时间5.0 ms左右，转化后的农杆菌在含50 mg·L-1卡那霉素、25 mg·L-1庆大霉素和50 mg·L-1利福平的YEP培养基上筛选，阳性克隆经菌落PCR
鉴定，并保存于-70℃待用。
1.4 农杆菌侵染
挑取含pTRV1、pTRV2、pTRV-GUS、pTRV-SlWRKY40和pTRV-PDS载体的农杆菌单菌落于YEP液体培养基中，28℃，200 rpm水平摇动培养24～48 h。然后，将各农杆菌在含有25 mL YEP液体培养基的三角瓶中分别扩大培养至OD600为0.8-1.0。离心机4℃条件下，4 000 g，离心10分钟，撇去上清收集菌体，然后重新悬浮于侵染液(10 mM MgCl2，10 mM MES pH 5.7，150 μM 乙酰丁香酮)至菌体终浓度OD600=1.0-1.5，室温放置3 h，等体积混合pTRV1与pTRV-GUS、pTRV2或pTRV-PDS等的农杆菌菌液，用去针头的1 mL注射器浸润接种10 d左右番茄的子叶。以pTRV-GUS注射植株做为对照。以pTRV-PDS VIGS构件侵染植株做为沉默时间参考以确定沉默时间(PDS沉默植株出现叶片退绿症状)，同时，用侵染源浸润番茄子叶作为植物生长状况对照，然后将番茄植株于22℃，60%～70%相对湿度条件下培养、观察。
1.5 基因沉默效率分析
利用实时定量PCR (RT-qPCR)检测SlWRKY40沉默效率。目的基因上下游引物分别为SlWRKY40-qRT-1F：TCAGGATCAGAACAGCGATGGA和SlWRKY40-qRT -1R：TCATCACTTGAGCTGCTCTCTG。
在侵染后4周左右，分别取对照和VIGS处理番茄叶片，提取RNA，用基因特异性引物进行RT-qPCR验证番茄内源基因的沉默情况。每个处理和对照至少取6个重复，最少进行3次独立实验。
总RNA样品用PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perf ect Real Time)(Takara)清除DNA污染，然后根据产品说明进行反转录，从而获得cDNA。以番茄Actin 基因(LeActin, accession number TC194780)做为内参。上下游引物分别为Actin-qRT -1F：AGGCACACAGGTGTTATGGT和Actin-qRT -1R：AGCAACTCGAAGCTCATTGT，用SYBR Green I 进行RT-qPCR反应，具体方法步骤参考 SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit (TAKARA ,Dalian, China) 使用说明书。
Real-Time PCR 反应仪器为CFX96TM Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD, California, USA)。
PCR反应条件是：95 ℃变性30 s；然后95 ℃ 20 s，57 ℃ 25 s和72 ℃ 20 s，循环40次；然后65℃ 15 s熔解曲线分析。数据利用Excel和2 -△△CT法进行分析。
2 结果与分析
2.1 SlWRKY40基因的克隆
本实验所克隆SlWRKY40的序列长度为1 121 bp, PCR电泳结果显示，目标基因符合预期大小(图1)，测序结果同NCBI数据库中的序列进行比对，结果也表明扩增的片段即为SlWRKY40基因。
2.2 SlWRKY40 基因VIGS表达载体构建
以测序正确的SlWRKY40基因序列为模板，以SlWRKY40 -vigs-1F和SlWRKY40 -vigs-1R为引物，PCR克隆SlWRKY40基因的477bp的VIGS载体插入序列。PCR扩增产物经验证，与预期基因片段大小一致。
基因插入序列电泳分离，割胶回收，然后与pTRV2表达载体分别用XbaI 和XhoI进行双酶切。
酶切产物纯化后连接过夜，连接产物热击法转化大肠杆菌JM109，选择单菌落进行PCR验证，同时扩大培养，选用阳性克隆的菌液提取质粒DNA，并用相应的内切酶进行双酶切鉴定，结果切离片段与目标基因片段大小一致(图2)，表明目标基因片段已经成功与沉默表达载体连接。
图1 SlWRKY40 cDNA全长序列的PCR扩增电泳结果M：DL2000 Marker ；1、2 ：SlWRKY40 cDNA全长序列
图2 SlWRKY40 VIGS载体双酶切验证M：Middle DNA MarkerⅠ；1 ：SlWRKY40 VIGS载体插入序列
2.3 农杆菌转化
通过电击转化法将鉴定无误的质粒DNA转化到农杆菌(GV3101)菌株中，挑取阳性克隆，用SlWRKY40特异上下游引物进行菌落PCR验证，并扩大培养，凝胶电泳出现477 bp基因片段，大小与预期相符(图3)，说明转化成功。
图3  SlWRKY40 VIGS载体菌落PCR验证M：DGL2000 Marker ；1～3 ：SlWRKY40VIGS
载体插入序列
2.4 SlWRKY40基因VIGS 沉默效率检验
2.4.1 表型观察 VIGS侵染处理后约4周左右，PDS时间参照植株的白化表型几乎蔓延番茄全株(图略)。Liu等用转化了pTRV2空载体的农杆菌侵染植物做为阴性对照[19]，后来发现该对照对植物生长有严重不利影响[20]，因此在pTRV2中插入一段植物中不存在的β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)序列(pTRV2-GUS)转化到农杆菌中侵染植物做为阴性对照[21]。同时，以含pTRV2-PDS的农杆菌侵染做为时间参照。为了再次印证pTRV2-GUS作为阴性对照的合理性，我们用无菌侵染液浸润子叶的番茄作为植物生长状况对照，结果SlWRKY40沉默植株与TRV-GUS处理对照植物同无菌侵染液处理番茄之间在外观性状上没有发现明显差异(图4)。说明我们的侵染体系具有可行性。

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