韩悦，孙丽娜，吕良禾，等.鼠李糖脂-纳米零价铁-丙酮酸钠强化微生物厌氧-好氧降解土壤DDTs 效果研究[J].农业环境科学学报,2023,42（4）：799-810.
HAN Y,SUN L N,LÜL H,et al.Anaerobic-aerobic bioremediation of DDT-contaminated soil and the compound strengthening of rhamnolipid-nano zero-valent iron-sodiu[J].Journal of Agro-Environment Science ,2023,42（4）：799-810.
鼠李糖脂-纳米零价铁-丙酮酸钠强化微生物厌氧-好氧降解土壤DDTs 效果研究
韩悦，孙丽娜*，吕良禾，王辉，苑春莉，王晓旭，吴昊
（沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室，沈阳110044）
Anaerobic-aerobic bioremediation of DDT-contaminated soil and the compound strengthening of
rhamnolipid-nano zero-valent iron-sodium pyruvate
HAN Yue,SUN Lina *,LÜLianghe,WANG Hui,YUAN Chunli,WANG Xiaoxu,WU Hao
（Key Laboratory of Regional Environment and Eco-Remediation of Ministry of Education,Shenyang University,Shenyang 110044,China ）Abstract ：Current dichlorodiphenyltrichloroethane （DDT ）-contaminated soil microbial remediation efficiency is relatively low.This study used an agricultural greenhouse soil facility in Shenbei New District of Shenyang as the research object of a batch experiment to study the enhancement of rhamnolipid （RL ）,nano zero-valent iron （nZVI ）,and sodium pyruvate （C ）on microbial sequential anaerobic-aerobic treatment for the degradation of DDT and its components.The results showed that the improved sequential anaerobic-aerobic treatments with RL,nZVI,and C significantly increased the degradation rates of DDT and p,p ′-DDT in soil （P <0.05）.The results also revealed that the degradation rates of DDT and p,p′-DDT in different enhanced treatments were in the order of RL+nZVI+C combined treatment >nZVI treatment >RL treatment >C treatment >CK treatment.After 90days of RL,nZVI,and C combined with enhanced microbial
anaerobic-aerobic sequential treatment,the degradation rates of DDT,p,p ′-DDT,and p,p′-DDE were 43.05%–68.81%,12.06%–96.90%,and 3.33%–60.87%,respectively.Among these,the degradation rates of DDT,p,p ′-DDT,and p,p′-DDE under the combined enhanced anaerobic-aerobic treatment with 0.05mg ·kg -1RL,0.50%nZVI,and 0.30mmol ·kg -1C were 68.81%,96.90%,and 60.87%
收稿日期：2022-08-03录用日期：2022-12-16作者简介：韩悦（1997—），女，辽宁阜新人，硕士研究生，主要从事污染土壤生态修复研究。E-mail ：*通信作者：孙丽娜E-mail ：基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（973计划）（2014CB441106）Project supported ：The National Basic Research Program of China （973Program ）（2014CB441106）
摘要：为了改善目前土壤DDTs 污染微生物修复效率相对较低的现状，以沈阳市沈北新区某设施农业大棚土壤为研究对象，通
过批实验研究了鼠李糖脂（RL ）、纳米零价铁（nZVI ）和丙酮酸钠（C ）强化微生物顺序厌氧-好氧处理对土壤DDTs 及其组分降解率的影响。结果表明：RL 、nZVI 和C 强化微生物顺序厌氧-好氧处理可显著提高土壤DDTs 和p ，p′-DDT 的降解率（P <0.05），不同强化处理土壤DDTs 和p ，p′-DDT 降解率依次为RL+nZVI+C 联合处理＞nZVI 处理>RL 处理>C 处理>CK 处理；RL 、nZVI 和C 联合强化微生物厌氧-好氧顺序处理90d 时，土壤DDTs 、p ，p′-DDT 和p ，p′-DDE 降解率分别为43.05%~68.81%、12.06%~96.90%和3.33%~60.87%。其中，0.05mg·kg -1RL 、0.50%nZVI 以及0.30mmol·kg -1C 联合强化厌氧-好氧处理土壤DDTs 、p ，p′-DDT 和p ，p′-DDE 降解率分别为68.81%、96.90%和60.87%，厌氧与好氧降解比分别为3.97、6.70和5.00。研究表明，RL 、nZVI 与C 联合强化微生物顺序厌氧脱氯与好氧放大处理，促进了土壤DDTs 高效降解，同时避免了难降解、毒性更大的p ，p′-DDE 的产生与积累，展示
了RL 、nZVI 与C 联合强化微生物顺序厌氧-好氧降解在修复DDTs 污染土壤方面的应用潜力。关键词：DDTs ；鼠李糖脂；纳米零价铁；丙酮酸钠；微生物修复中图分类号：X53
文献标志码：A
文章编号：1672-2043（2023）04-0799-12
doi:10.11654/jaes.2022-0786
滴滴涕（DDTs）作为典型的有机氯农药，因其应用范围广、能更有效地消灭害虫，从而得到了广泛应用[1]。然而，DDTs具有高毒性、持久性和高度生物蓄积性，对环境和人类健康具有严重危害性，大部分国家已经停止DDTs的农业使用[2]。尽管我国在1983年就已经禁止了DDTs的生产和使用，但DDTs的残留物及其代谢产物却一直不同程度地存在于我国土壤中[3]。相关调查显示，我国东北大部分地区农业土壤
DDTs检出率大于80%，南方主要城市土壤DDTs检出率为100%，其中土壤DDTs残留量最高达到1824μg·kg-1[4-5]。有效地去除土壤DDTs及其代谢产物污染显得尤为重要。
DDTs污染土壤修复方法主要包括化学修复、物理修复、生物修复等[6]。其中，微生物修复因其成本低、操作简单、环境友好，已作为目前最具有前景的绿修复技术之一[7]，被广泛用于去除各种土壤污染物的研究[8]。虽然DDTs在好氧和厌氧条件下均可被降解，但是，DDTs毒性大、结构复杂，土壤DDTs污染的单一好氧微生物修复或厌氧微生物修复的效率均相对较低[9-10]，如王晓旭等[11]用混合菌修复DDTs污染土壤，DDTs好氧降解率最高为50.50%；Bao等[12]利用硫酸盐还原菌进行p，p′-DDT污染土壤修复，其p，p′-DDT厌氧降解率为45.80%。一些研究已经证明厌氧-好氧联合处理能进一步提高微生物对卤代烃类污染物的降解效率，但其对DDTs的污染修复还鲜见报道[13-14]。DDTs是典型的疏水性有机化合物（HOCs），其疏水性高、水溶性低，容易被土壤基质吸附，对土壤微生物的生物有效性相对较低[11]，是土壤微生物修复效率低下的主要原因之一。鼠李糖脂（RL）可以提高HOCs在水中的表观溶解度，进而提高土壤DDTs的微生物有效性和微生物修复效率[15]，是提高土壤DDTs生物有效性的可行途径[16]。陈苏等[17]的研究表明，RL强化能有效促进污染土壤中DDTs的微生物降解，土壤DDTs微生物降解率提升了25.89%。
土壤中的碳源和电子供体的缺乏也是限制土壤微生物生长和活性的主要因素。向污染土壤中投加
电子供体或电子受体是目前研究最为广泛的生物刺激方法，能够有效提高污染土壤的微生物修复效率。在厌氧环境下，微生物可利用外源电子使土壤DDTs 还原脱氯[18]。纳米零价铁（nZVI）是一种强非特异性还原剂，目前已广泛用于持久性有机污染物的厌氧降解研究。nZVI一方面通过降低氧化还原
电位加速土壤DDTs还原脱氯过程[19]，提高土壤DDTs的厌氧降解效果[20]，促进土壤有机污染的厌氧修复[21]；另一方面，
nZVI还可与土壤DDTs直接作用，有效降低土壤中DDTs的吸附浓度[22]，提高土壤DDTs的微生物有效性，促进土壤DDTs厌氧降解。Singh等[22]针对土壤吸附的DDT及其残留物，通过添加nZVI使土壤DDTr （滴滴涕及其残留物）残留浓度下降了40.00%。nZVI 与有机质类电子供体丙酮酸钠（C）联合使用时，C可连续去除nZVI的钝化层，进一步提高nZVI对DDTs 等污染物的氧化还原能力，提高污染物的脱氯效果[23]。万金泉等[23]研究了还原脱氯的过程中C为外加电子供体对三氯苯酚脱氯效果的影响，结果表明C的添加有效提高了微生物脱氢酶活性，促进了三氯苯酚的降解。
综上所述，厌氧还原降解和好氧生物降解结合可能是提高土壤DDTs降解率的有效途径[24-26]。目前，微生物降解土壤DDTs的研究多为厌氧降解或好氧降解，微生物厌氧、好氧联合降解的研究较少；RL、nZVI 与C强化微生物降解土壤DDTs研究多为单一强化研究，RL、nZVI与C联合强化微生物降解土壤DDTs鲜有研究。因此，本研究旨在通过研究RL、nZVI与C强化微生物顺序厌氧-好氧处理对土壤DDTs降解效果的影响，筛选DDTs污染土壤的高效修复技术，并探究其修复机制，为土壤DDTs污染高效修复提供参考。1材料与方法
1.1污染土壤制备
实验用土采自沈阳市沈北新区某设施农业大棚土壤，地理坐标为42°05′02.62″N，123°31′42.79″E。收集表层0~20cm土壤，弃去杂物后混合、风干、过2
RL,nZVI,and C enhances microbial sequential treatment of anaerobic dechlorination and aerobic amplification,which promotes the efficient degradation of DDT in soil,and avoided the production and accumulation of p,p′-DDE,which is difficult to degrade and more toxic.This study also demonstrates the potential of combined RL,nZVI,and C to enhance microbial sequential anaerobic-aerobic degradation in the remediation of DDT-contaminated soil.
Keywords：DDT;rhamnolipid;nano zero-valent iron;sodium pyruvate;microbial remediation
使其充分溶解，之后将其喷洒到风干的土壤中，边喷
洒边搅拌至丙酮完全挥发后，于室温下放置9个月，使污染物充分老化。将老化的DDTs 污染土壤反复按照四分法充分混合后，再次按四分法取样。分析土壤理化性质如下：土壤砂粒、粉粒和黏粒占比分别为1.07%、72.82%和26.11%；土壤有机质为54.37g ·kg -1；土壤pH 为7.27；土壤CEC 为13.09cmol·kg -1；土壤DDTs 、p ，p′-DDT 、p ，p′-DDD 及p ，p′-DDE 分别为
1.02、0.92、0.04mg·kg -1及0.06mg·kg -1。1.2实验材料与实验设计
RL 购自湖州紫金生物科技有限公司；nZVI 和C
购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；p ，p′-DDT ，o ，p′-DDT ，p ，p′-DDE ，p ，p′-DDD 等DDTs 标准样品购自百灵威化学技术有限公司。实验用微生物为本研究团队筛选的DDTs 和PAHs 高效降解菌（Rhodo⁃coccus rhodochrous ，红球菌属，放线菌门，菌种保藏号为CGMCC No.25155）。基于充分的文献调研
[11，27-29]
和
前期实验研究，设置了RL 、nZVI 与C 联合强化微生物顺序厌氧-好氧处理实验，RL 、nZVI 与C 分别设计3个浓度，共设置37组处理，每组处理设置3个平行（见表1）。
1.3厌氧实验与好氧实验
厌氧降解装置为50mL 培养瓶（血清瓶）。首先
将培养瓶进行高温灭菌和编号，并按实验设计分别称取10g 制备的DDTs 污染土壤于对应编号的培养瓶中，再分别称取0.05、0.10、0.20mg RL ，0.05、0.10、0.20g nZVI 和0.10、0.20、0.30mmol C 于对应编号的培养瓶中。向培养瓶中填充超纯去离子水至瓶顶部
以确保浸水条件，之后于密闭的厌氧手套箱（购自英国Don Whitley Scientific 公司，DG250）内抽真空至10
5
kPa 时，向培养箱内充氮气至真空表读数略超过大气压数值为止。上述抽真空和充氮操作循环3次后，再持续通入氮气12h ，使土壤和溶液中的氧气完全被氮气置换（氧气含量低于0.01%V /V ），最后用特氟龙涂层丁基橡胶瓶塞将瓶子密封。将培养瓶密封并移出厌氧手套箱至30℃恒温培养箱避光培养60d 。此时，对所有处理样品进行破坏性取样并进行冻干，一半样品用于厌氧降解效果分析，另外一半样品移至10mL 小烧杯中用于好氧降解实验：向小烧杯中添加1mL1.0×109CFU·mL -1Rhodococcus rhodochrous 降解菌
并混匀，在田间持水量的60%好氧降解，30d 后将样品进行冻干处理待测。表1实验设计
CK
RL 5
RL 10RL 20
Fe 0.5Fe 1Fe 2C10C20C30RL5+Fe0.5+C10RL5+Fe0.5+C20RL5+Fe0.5+C30RL5+Fe1+C10RL5+Fe1+C20RL5+Fe1+C30RL5+Fe2+C10RL5+Fe2+C20RL5+Fe2+C30
RL10+Fe0.5+C10RL10+Fe0.5+C20RL10+Fe0.5+C30RL10+Fe1+C10RL10+Fe1+C20RL10+Fe1+C30RL10+Fe2+C10RL10+Fe2+C20RL10+Fe2+C30RL20+Fe0.5+C10RL20+Fe0.5+C20RL20+Fe0.5+C30RL20+Fe1+C10RL20+Fe1+C20RL20+Fe1+C30RL20+Fe2+C10RL20+Fe2+C20RL20+Fe2+C30-5
1020------555555555101010101010101010202020202020202020----
0.512---
0.50.50.51112220.50.50.51112220.50.50.5111222-------102030102030102030102030102030102030102030102030102030102030-
1.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×1091.0×109
注Note ：CK=Blank control （空白对照）；RL=Rhamnolipid （鼠李糖
脂）；Fe=nZVI （纳米零价铁）；C=Sodium pyruvate （丙酮酸钠）；n =3。
2.5g样品于加入滤膜的萃取池中，继续用硅藻土装满萃取池并将上盖拧紧后置于加速溶剂萃取仪上进行萃取。萃取剂为1∶1丙酮和正己烷混合液，萃取温度100℃、压力10.3×106Pa、萃取时间5min，淋洗体积为60%萃取池体积，氮气吹脱100s，萃取重复2次。将萃取液移至50mL鸡心瓶中，在37℃旋转蒸发仪（购自上海亚荣生化仪器有限公司，RE-52AA）上旋转蒸发，正己烷定容，采用浓硫酸净化法，NaCl溶液洗脱后过滤、定容待测。
1.5土壤DDTs测定
DDTs用气相谱仪（购自美国瓦里安公司，VARIANCP-3800）进行测定。气相谱分析条件：谱柱类型，CP－sil8CB型石英毛细管柱（30m×0.32 mm×0.25pm）；柱温，初始温度120℃并保持1min，以25℃·min-1升至230℃，再以3℃·min-1升至255℃，最后以20℃·min-1升至280℃保持5min；
载气，高纯氮气；流速，0.6mL·min-1；进样量为1μL。以谱峰保留时间定性，外标法定量，方法回收率89.2%~ 107.1%。
1.6数据处理
实验所获得的数据采用Origin.2018和SPSS统计分析软件进行数据处理和作图。
土壤某污染物降解率为处理前土壤该污染物浓度与处理后土壤该污染物浓度之差除以处理前土壤该污染物浓度。
2结果与分析
2.1RL、nZVI和C强化处理对土壤DDTs降解效果的影响
图1为RL、nZVI和C强化微生物厌氧-好氧处理90d时土壤DDTs的降解率。从图1可以看出，在强化厌氧-好氧生物处理90d时，RL、nZVI和C联合强化处理土壤的DDTs降解率为43.05%~68.81%，分别比nZVI、C和RL单一强化处理高出20.09%、33.25%和27.69%；比CK处理高出46.69%。其中RL5+nZ⁃VI0.5+C30和RL5+nZVI0.5+C20处理对土壤DDTs降解率最高，分别为68.81%和68.66%。不同强化处理土壤DDTs降解率为nZVI+RL+C强化处理（53.57%）> nZVI强化处理（33.48%）>RL强化处理（25.88%）>C强化处理（20.32%），CK处理时土壤DDTs降解率最低，为6.88%。
不同浓度RL、nZVI和C联合强化厌氧处理60d
时，土壤DDTs的降解率为29.94%~54.95%；不同厌氧处理土壤的DDTs厌氧降解率为nZVI+RL+C处理（38.11%）>nZVI处理（20.11%）>RL处理（19.05%）>C 处理（13.40%）>CK（4.19%）；后续好氧生物放大处理
30d的土壤DDTs降解率为9.61%~27.90%，厌氧降解率与好氧降解率比值为3.07，不同强化处理土壤的厌氧/好氧降解比为nZVI+RL+C处理（3.07）>RL处理（2.93）>C处理（2.07）>CK（1.56）>nZVI处理（1.32）。其中，RL5+nZVI0.5+C30联合处理土壤的DDTs厌氧降解率最高，为54.95%，比nZVI、RL和C强化处理分别提高了1.88、1.87倍和3.10倍，其厌氧降解率与好氧降解率比值为3.97。
2.2RL、nZVI和C强化处理对土壤DDTs组成的影响
RL、nZVI和C强化厌氧、好氧处理90d时（见图2），土壤中p，p′-DDT、p，p′-DDE的残留浓度明显降低（P<0.05），不同处理之间土壤p，p′-DDT、p，p′-DDD和p，p′-DDE残留浓度所占比例分别为23.19%、69.44%和7.37%。不同强化处理后土壤p，p′-DDT残留浓度由初始的923.03μg·kg-1降低为28.59~811.68μg·kg-1，p，p′-DDE的残留浓度由初始的59.53μg·kg-1降低为23.71~50.10μg·kg-1；不同强化处理后土壤p，p′-DDT降解率为12.06%~96.90%，p，p′-DDE降解率为3.33%~60.87%。但土壤p，p′-DDD的残留量不减反增（P<0.05），不同强化处理后土壤p，p′-DDD残留浓度由初始的35.84μg·
kg-1增高到100.15~491.23μg·kg-1。其中，RL5+nZVI0.5+C30强化处理土壤的p，p′-DDT和p，p′-DDE残留浓度最低，分别为28.59μg·kg-1和23.71μg·kg-1，比CK处理土壤分别降低了783.09μg·kg-1和32.73μg·kg-1，比RL处理土壤分别降低了479.60μg·kg-1和18.57μg·kg-1，比nZVI处理土壤分别降低了109.36μg·kg-1和24.48μg·kg-1，比C处理土壤分别降低了539.34μg·kg-1和14.65μg·kg-1；土壤p，p′-DDT和p，p′-DDE降解率最高，分别为96.90%和60.87%，比CK处理土壤分别提高84.84%和40.29%，比RL处理土壤分别提高51.95%和36.51%，比nZVI处理土壤分别提高11.85%和47.42%，比C处理土壤分别提高65.50%和31.89%。而p，p′-DDD残留浓度为491.23μg·kg-1，分别比CK、RL、C和nZVI处理土壤增加了391.08、286.85、266.83μg·kg-1和256.77μg·kg-1。
在厌氧处理阶段（图3），不同处理土壤p，p′-DDT残留浓度显著降低（P<0.05），由初始的923.03μg·kg-1降低为60.05~828.02μg·kg-1，不同处理土壤
p ，p′-DDT 残留浓度依次为RL+nZVI+C （98.74μg·kg -1）<nZVI （183.98μg·kg -1）<RL （648.82μg·kg -1）<C （654.69μg·kg -1）<CK （828.02μg·kg -1）；土壤p ，p′-DDE 残留浓度降低
的幅度相对较小，由初始的59.53μg·kg -1降低为29.68~54.53μg·kg -1，p ，p′-DDE 残留浓度依次为RL+nZVI+C （29.68μg·kg -1）<nZVI （48.74μg·kg -1）<RL （48.82μg·kg -1）<C （48.90μg·kg -1）<CK
degrade（54.53μg·kg -1）；其中，RL5+nZVI0.5+C30强化处理土壤的p ，p′-DDT 、p ，p′-DDE 降解率最高，分别为93.49%、50.15%，厌氧-好氧降解比分别为6.70和5.00。而土壤p ，p′-DDD 残留浓度显著增高（P <0.05），由初始的35.84μg·kg -1增高到98.47~569.22μg·kg -1，土壤p ，p′-DDD 残留浓度依次为RL+nZVI+C （569.22μg ·kg -1）>nZVI （562.84μg μg·kg -1）>CK （111.14μg·kg -1）>RL （在后续的好氧处理阶段（图4），土壤p ，p′-DDD 残留浓度降低得最为显著（P <0.05），好氧降解率为31.00%~480.00%。不同强化处理土壤的p ，p′-DDD
好氧降解率为RL +nZVI +C （301.03%）>nZVI （234.68%）>RL （219.35%）>C （53.26%）>CK （31.00%）；其次为土壤p ，p′-DDE ，好氧降解率为0.63%~48.00%，不同强化处理土壤p ，p′-DDE 好氧降解率为RL +nZVI +C （27.55%）>C （27.06%）>nZVI （25.79%）>RL （13.54%）>CK （5.85%）；土壤p ，p′-DDT 的残留浓度降低得最少，其好氧降解率为0.84%~20.65%，不同强化处理土壤的p ，p′-DDT 好氧降解率为RL+nZVI+C （16.93%）>RL （16.62%）>C （15.19%）>不同小写字母表示处理间差异显示（P <0.05）。下同。Different lowercase letters indicate significant differences among treatments （P <0.05）.The same below.
图1RL 、nZVI 和C 联合对DDTs 厌氧-好氧降解情况
Figure 1Anaerobic-aerobic degradation rate of DDTs enhanced by RL ，nZVI and C

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