不同离心条件所制PRF 的生长因子释放水平及促成纤维细胞增殖、迁移作用比较
贺波1，2，霍继武1，熊竹友1，蒋邦红1，陈宇1，李光早1
1蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠233000；2组织移植安徽省重点实验室
摘要：目的
观察并比较不同离心条件制得的富血小板纤维蛋白（PRF ）的生长因子释放水平及对成纤维细胞
增殖、迁移的作用。方法
采用心脏采血法获得SD 大鼠全血，分别以708g 12min 、208g 14min 、208g 8min 三种离
心程序获得富白细胞PRF （L -PRF ）、高级PRF （A -PRF ）、高级PRF+（A -PRF+），压制得到PRF 膜片后，置于DMEM /F12培养基中，分别于1h 、6h 、1d 、3d 、5d 后收集培养基，采用ELISA 法检测培养基中的血小板衍生生长因子
（PDGF -AB ）、转化生长因子β（TGF -β）、血管内皮生长因子（VEGF ）。取SD 大鼠背部皮肤分离、培养获得皮肤成纤维细胞，将细胞分为L -PRF 组、A -PRF 组、A -PRF+组、空白组，分别以L -PR
F 、A -PRF 、A -PRF+条件培养基和10%FBS 培养基培养，采用CCK -8细胞增殖实验检测细胞增殖能力、Transwell 小室实验检测细胞迁移能力。结果
制备5d 内
A -PRF 、A -PRF+培养基的PDGF -A
B 、TGF -β、VEGF 总释放水平高于L -PRF 培养基（P 均<0.05）。A -PRF+组、A -PRF 组、L -PRF 组培养3、5d 时细胞增殖能力均高于空白组，且培养3d 时A -PRF+组、A -PRF 组细胞增殖能力高于L -PRF 组（P 均<0.05）。L -PRF 组、A -PRF 组、A -PRF+组穿膜细胞数高于空白组，且A -PRF 组、A -PRF+组穿膜细胞数高于L -PRF 组（P 均<0.05）。结论
通过降低相对离心力制备得到的A -PRF+和A -PRF 的生长因子释放性能、促进成纤
维细胞增殖和迁移作用明显强于L -PRF ，且适当缩短离心时间得到的A -PRF+作用更强。
关键词：皮肤成纤维细胞；富血小板纤维蛋白；相对离心力；生长因子；细胞增殖；细胞迁移
doi ：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.08.006中图分类号：R622
文献标志码：A
文章编号：1002-266X （2021）08-0024-04
Comparison of growth factor release levels and effects on promoting fibroblast proliferation and migra⁃tion in PRF prepared under different centrifugal conditions
HE Bo 1，HUO Jiwu ，XIONG Zhuyou ，JIANG Banghong ，CHEN Yu ，LI Guangzao 1The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College ，Bengbu 233000，China
Abstract ：Objective
To observe and compare the growth factor release levels of platelet -rich fibrin （PRF ）pre⁃
pared under different centrifugation conditions and its effect on the proliferation and migration of fibroblasts.Methods The whole blood of SD rats was obtained by cardiac blood sampling ，and the leukocyte -rich PRF （L -PRF ），advanced PRF
（A -PRF ），and advanced PRF+（A -PRF+）were obtained by three centrifugal procedures of 708g 12min ，208g 14min ，and 208g 8min.The PRF diaphragm was pressed and placed in DMEM /F12medium which was then collected at 1h ，6h ，1d ，3d ，and 5d ，respectively.The platelet -derived growth factor （PDGF -Ab ），transforming growth factor β（TGF -β），and vascular endot
helial growth factor （VEGF ）in the culture medium were detected by ELISA.Skin fibroblasts were isolated and cultured from the dorsal skin of SD rats ，and then were divided into the L -PRF group ，A -PRF group ，A -PRF+group ，and blank group ，which were cultured in L -PRF ，A -PRF ，and A -PRF+conditioned medium and 10%FBS medi⁃
um ，respectively.CCK -8cell proliferation assay was used to detect cell proliferation ，and Transwell chamber assay was used to detect cell migration.Results
The overall release levels of PDGF -Ab ，TGF -βand VEGF in A -PRF and A -PRF+
medium were higher than those in L -PRF medium within 5days after preparation （all P <0.05）.The cell proliferation abili⁃ties of the A -PRF+group ，A -PRF group ，and L -PRF group were higher than that of blank group on day 3and 5，and the cell proliferation abilities of the A -PRF+group and A -PRF group were higher than that of L -PRF group on day 3（all P <0.05）.The numbers of transmembrane cells in the L -PRF group ，A -PRF group ，and A -PRF+group were higher than that
基金项目：安徽省科技攻关项目（1704a0802162）；安徽省教育厅重点项目（KJ2019A0345）。
第一作者简介：贺波（1993-），男，硕士研究生，主要研究方向为组织移植与体表再生。E -mail ：1336973699@qq 通信作者简介：李光早（1964-），男，主任医师，教授，主要研究方向为先天性唇腭裂畸形修补、组织移植与体表再生。E -mail ：lgzbbah@163
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标识码（OSID ）
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in the blank group，and the numbers of transmembrane cells in the A-PRF group and A-PRF+group were higher than that in the L-PRF group（all P<0.05）.Conclusion The effects of A-PRF+and A-PRF prepared by reducing the relative cen⁃trifugal force on the growth factor release and promoting the proliferation and migration of fibroblasts were significantly stron⁃ger than that of L-PRF，and the effects of A-PRF+obtained by appropriately shorting the centrifugal time were stronger.
Key words：skin fibroblasts；platelet-rich fibrin；relative centrifugal force；growth factor；cell proliferation；cell migration
富血小板纤维蛋白（PRF）作为新一代血小板制品，因其制作简单、具有独特三维纤维网状结构［1］
、能够携带多种促生长因子［2］、不含富血小板血浆（PRP）所需的抗凝剂等优点，被用于多种领域，如创面愈合［3］、口腔种植医学等［4］。PRF制备方法多种多样，基于不同离心条件可制得不同的PRF制品，如可注射型PRF、富白细胞PRF（L-PRF）、高级PRF （A-PRF）、高级PRF+（A-PRF+）等［5-7］。不同的PRF 制品生长因子含量也有所差异。成纤维细胞作为皮肤真皮层的重要组成细胞，在创面愈合的新生肉芽组织形成及胶原蛋白分泌过程中发挥至关重要的作用［8］。2020年5月—9月，本研究观察了L-PRF、
A-PRF、A-PRF+三种制品中血小板衍生生长因子（PDGF-AB）、转化生长因子β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）释放水平及各PRF制品对皮肤成纤维细胞增殖、迁移的作用，深入了解不同PRF制品对成纤维细胞生长能力影响的差异性。
1材料与方法
1.1实验动物与主要材料健康成年雄性SD大鼠30只，SPF级，体质量300~400g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证编号为SCXK（鲁）2019003。动物实验流程已通过蚌埠医学院动物伦理委员会批准（2020第145号）。特级胎牛血清（FBS）购自CLARK公司。DMEM/F12培养基、PBS 缓冲液均购自HyClone公司。青霉素—链霉素双抗、胰酶细胞消化液、CCK-8试剂、FITC标记山羊抗兔荧光二抗均购自Biosharp公司。Ⅰ型胶原酶购自Yeason公司。4%多聚甲醛、DAPI试剂、5%BSA封闭
液购自Solarbio公司。波形蛋白（Vimention）一抗购自武汉三鹰生物公司。Transwell嵌套购自Cron⁃ing公司。TritionX-100购自BioFRoxx公司。大鼠PDGF-AB、TGF-β、VEGF的ELISA试剂盒均购自酶联生物公司。
1.2不同PRF制品制备及条件培养基的获取以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，75%乙醇消毒左胸部皮肤，采血针于心尖搏动明显处穿刺采血，用10mL不含抗凝剂的采血管采集大鼠血液9~10mL，置于离心机中。分别以708g离心12min、208g离心14min、208g离心8min制备得到L-PRF、A-PRF、A-PRF+。弃去上层较清亮的贫血小板血浆层及下层的红细胞层，保留中层胶冻状的PRF及少量PRF 与红细胞交界层，置于超净台内无菌纱布上。将取出的PRF制品放于两层无菌纱布之间，压平后分别置于24孔板内，加入等量含10%FBS及1%双抗的DMEM/F12培养基约2mL，置于细胞培养箱内孵育。分别于操作后1h、6h、1d、3d、5d收集孔板内条件培养基，-20℃保存备用。每次收集后重新加入等量培养基继续孵育。
1.3PRF析出液中生长因子检测取出各组条件培养基，待溶解后，置入离心机中，2000r/min离心5min，分离杂质内容物，收集上清液，采用ELISA法检测PDGF-AB、TGF-β、VEGF。
1.4PRF对成纤维细胞增殖、迁移作用观察1.4.1成纤维细胞的分离培养及鉴定取健康成年SD大鼠，背部取皮区剔毛备皮，碘伏及75%乙醇消毒，取得2cm×2cm的背部皮肤，置于75%乙醇中浸泡约20min。
将标本放入超净台中，于含双抗的PBS中浸泡10min。用无菌刀片剔除表皮层及皮下组织，PBS缓冲液漂洗干净后剪成2mm×2mm组织颗粒，放入含0.25%Ⅰ型胶原酶的离心管内消化。将离心管放入37℃、CO2培养箱中消化5h，每隔30 min摇晃震荡1次。待组织基本消化后，经70µm细胞滤器过滤去除杂质，置于离心机内2000r/min离心6min。弃去管内液体，用含10%FBS的DMEM培养基吹打后分装入T25培养瓶内，置于培养箱培养，待细胞贴壁后，3d换1次液。待细胞生长至融合度80%~90%时进行传代，将P3细胞以9×103/孔接种于12孔板的2孔中，待细胞生长至铺满孔径的90%时，进行Vimentin免疫荧光实验鉴定。成纤维细胞在倒置显微镜下多数呈长梭形，部分呈扁平星形或三角形分布，细胞突起明显。细胞抗Vimentin染呈绿，均为阳性表达，细胞核呈椭圆形，被DAPI染液染成蓝，胞质透明不着。
1.4.2细胞增殖能力检测取P3代成纤维细胞，以2×103/孔接种于96孔板中预培养24h，取不同PRF条件培养基，使用总体积的20%［9］。将细胞分
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为L-PRF组、A-PRF组、A-PRF+组、空白组，每组设3个复孔，分别以L-PRF、A-PRF、A-PRF+条件培养基和10%FBS培养基培养。分别于培养后1、3、5d加入10µL的CCK-8试剂，孵育2h后，酶标仪测定
450nm波长处的光密度（OD）值表示细胞增殖能力。
1.4.3细胞迁移能力检测取P3代成纤维细胞，消化离心后，PBS清洗2次，用不含PBS的培养基重悬，调整细胞密度，取200µL约4×104个细胞的悬液加入上层室，下层室分别加入L-PRF、A-PRF、A-PRF+条件培养基和10%FBS培养基各600µL，每组设3个复孔。24h后，用镊子夹出上室，内表面用棉棒轻柔刮擦以去除内侧面细胞，PBS清洗2次，稍作风干后，以4%多聚甲醛（上室200µL、下室500µL）固定15min，PBS清洗2次。加入500µL的0.1%结晶紫染液于下室内，染20min。PBS清洗2次，置于新孔，小室内加100µL PBS，镜下观察拍照。1.5统计学方法采用Graphpad Prism8.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。以P<0.05为差异有统计学意义。2结果
2.1各PRF条件培养基中生长因子释放水平比较L-PRF培养基中PDGF-AB水平于6h时达最高值，之后缓慢下降；A-PRF及A-PRF+培养基前3d呈上升趋势，后开始下降；A-PRF、A-PRF+培养基制备1d后PDGF-AB释放水平高于L-PRF，且A-PRF+培养基制备1、3d时PDGF-AB释放水平高于A-PRF（P 均<0.05）。L-PRF培养基中TGF-β释放水平于1d 前均呈上升趋势，后开始下降，A-PRF、A-PRF+总体呈上升趋势；制备6h后，L-PRF、A-PRF、A-PRF+培养基TGF-β释放水平依次增高（P均<0.05）。各PRF培养基中的VEGF于制备后6h释放达最高值，后明显降低；A-PRF、A-PRF+培养基制备1d后VEGF释放水平高于L-PRF，A-PRF+培养基制备
6h、5d后VEGF释放水平高于A-PRF（P均<0.05）。制备5d内A-PRF、A-PRF+培养基PDGF-AB、TGF-β、VEGF总体释放水平高于L-PRF培养基（P均< 0.05）。见表1、表2。
2.2各组细胞增殖能力比较见表3。
2.3各组细胞迁移能力比较空白组、L-PRF组、A-PRF组、A-PRF+组培养24h后穿膜细胞数分别为（24.01±2.41）、（40.81±2.61）、（66.91±2.21）、（74.51±
3.55）个。L-PRF组、A-PRF组、A-PRF+组穿膜细胞数高于空白组，且A-PRF组、A-PRF+组穿膜细胞数高于L-PRF组（P均<0.05）。3讨论
随着整复学科的迅速发展，自体血液提取物开始推广应用。PRF作为第二代血富血小板制品，相较于PRP，其无需使用如抗凝剂等的添加剂，三维空间网状结构可容纳更多生长因子，制备简单，并且还提供了三维纤维蛋白基质，可用作多种程序的支架，在引导性骨再生和引导性组织再生程序中发挥屏障膜功能［10］。鉴于这些优点，PRF已被广泛应用于创面修复、齿槽裂骨修复等领域［11-12］。
PRF富含多种生长因子，血小板内的α颗粒被表1各PRF条件培养基制备不同时点PDGF-AB、TGF-β、VEGF释放水平比较（-x±s）
培养基
L-PRF
1h
6h
1d
3d
5d
A-PRF
1h
6h
1d
3d
5d
A-PRF+
1h
6h
1d
3d
5d
PDGF-AB（pg/mL）
1869.27±96.76
2178.51±113.66
1862.39±96.87
1566.26±22.01
899.29±16.15
1752.43±76.81
1997.03±53.75
2176.64±42.22*
2541.30±97.45*
2153.16±118.68*
1799.55±44.77
2053.15±67.65
2769.87±46.07*△
3247.44±103.63*△
2397.93±115.51*
TGF-β（ng/mL）
2.71±0.15
4.56±0.17
6.84±0.39
3.33±1.35
2.75±0.17
2.98±0.58
5.83±0.09*
9.75±0.44*
11.77±1.28*
6.40±0.84*
3.58±0.13
6.81±0.32*△
12.40±1.04*△
16.10±0.69*△
proliferation11.64±0.91*△
VEGF（pg/mL）
54.35±2.25
72.56±2.24
36.41±2.00
31.13±2.04
22.84±2.65
69.89±2.95*
80.92±1.66*
43.29±1.08*
40.33±1.75*
23.39±1.81
69.19±0.64*
88.96±1.83*△
43.13±2.37*
41.91±2.21*
33.66±1.99*△
注：与L-PRF相比，*P<0.05；与A-PRF相比，△P<0.05。
表2各PRF条件培养基制备5d内PDGF-AB、TGF-β、VEGF总释放水平比较（-x±s）
培养基
L-PRF
A-PRF
A-PRF+
PDGF-AB（pg/mL）
8375.68±273.96
1062.55±306.31*
12267.95±239.01*△
TGF-β（ng/mL）
20.19±1.56
36.73±1.94*
50.53±1.38*△
VEGF（pg/mL）
217.28±4.02
257.81±6.12*
276.85±6.20*△注：与L-PRF相比，*P<0.05；与A-PRF相比，△P<0.05。
表3各组培养不同时间细胞增殖能力比较（-x±s）
组别
A-PRF+组
A-PRF组
L-PRF组
空白组
细胞增殖能力
1d
0.38±0.03
0.28±0.02
0.29±0.04
0.35±0.04
3d
1.41±0.10*△
1.31±0.06*△
1.10±0.02*
0.62±0.01
5d
1.76±0.09*
1.72±0.03*
1.59±0.07*
0.98±0.12
注：与空白组相比，*P<0.05；与L-PRF组相比，△P<0.05。
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激活后，会缓慢释放多种生长因子，包括PDGF-AB、TGF-β、VEGF，PDGF和TGF-β可刺激成纤维细胞迁移并上调整联蛋白受体的表达，而VEGF在创面愈合过程中可刺激新生血管生长［13］。这些因子之间相互平衡制约，在组织愈合过程中都发挥着重要的作用［14］。近年研究报道，低速离心条
件制备的A-PRF、A-PRF+更有利于纤维蛋白内多种生长因子的释放。研究发现，L-PRF、PRP、A-PRF+三者比较，以A-PRF+的生长因子释放量更高［15］。也有学者报道，减少相对离心力则PRF生长因子释放能力更强［16］。GHANAA⁃TI等［7］认为，过高的离心速度会导致白细胞和其他生长因子损失，利用较低的离心速度有助于提高白细胞和生长因子的数量。然而DOHAN EHRENFEST等［17］的研究表明，较高离心力制备出的L-PRF的结构更加稳定，所释放的生长因子含量更高。上述实验结果的差异可能与PRF制作工艺的选择有关。
本研究利用不同相对离心力及离心时间分别制备得到L-PRF、A-PRF、A-PRF+，并将其置于不同的培养基中获得PRF条件培养基，利用ELISA法测定各时间段的培养基生长因子释放情况及累计释放总量，结果显示，制备5d内A-PRF、A-PRF+培养基PDGF-AB、TGF-β、VEGF总体释放水平高于L-PRF 培养基，提示A-PRF、A-PRF+培养基的PDGF-AB、TGF-β、VEGF释放能力强于L-PRF培养基，且以A-PRF+培养基作用最强。进一步利用富含PRF渗出液的培养基培养成纤维细胞，观察其增殖、迁移能力的变化。A-PRF+组、A-PRF组、L-PRF组培养3、5d 时细胞增殖能力均高于空白组，且培养3d时A-PRF+组、A-PRF组细胞增殖能力高于L-PRF组；L-PRF组、A-PRF组、A-PRF+组穿膜细胞数高于空白组，且A-PRF组、A-PRF+组穿膜细胞数高于L-PRF组。这提示在组织修复的过程中，较低的离心力制备得到的PRF能够更加有效地促进成纤维细胞于创口处大量募集与增殖，促进创面愈合。
结合上述研究结果，我们认为，通过降低相对离心力制备得到的A-PRF+和A-PRF的生长因子释放性能
、促进成纤维细胞增殖和迁移的作用明显强于L-PRF，且适当缩短离心时间得到的A-PRF+作用更强。参考文献：
［1］DOHAN D M，CHOUKROUN J，DISS A，et al.Platelet-rich fi⁃brin（PRF）：a second-generation platelet concentrate.Part I：technological concepts and evolution［J］.Oral Surg Oral Med
Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：37-44.
［2］DOHAN D M，CHOUKROUN J，DISS A，et al.Platelet-rich fi⁃brin（PRF）：a second-generation platelet concentrate.Part II：platelet-related biologic features［J］.Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：45-50.
［3］JEE C H，EOM N Y，JANG H M，et al.Effect of autologous platelet-rich plasma application on cutaneous wound healing in
dogs［J］.J Vet Sci，2016，17（1）：79-87.
［4］MIRON R J，ZUCCHELLI G，PIKOS M A，et al.Use of platelet-rich fibrin in regenerative dentistry：a systematic review［J］.Clin
Oral Investig，2017，21（6）：1913-1927.
［5］RAOUF MABD EL，WANG X，MIUSI S，et al.Injectable-plate⁃let rich fibrin using the low speed centrifugation concept improves
cartilage regeneration when compared to platelet-rich plasma［J］.
Platelets，2019，30（2）：213-221.
［6］WANG X，YANG Y，ZHANG Y，et al.Fluid platelet-rich fibrin stimulates greater dermal skin fibroblast cell migration，prolifera⁃
tion，and collagen synthesis when compared to platelet-rich plas⁃
ma［J］.J Cosmet Dermatol，2019，18（6）：2004-2010.
［7］GHANAATI S，BOOMS P，ORLOWSKA A，et al.Advanced platelet-rich fibrin：a new concept for cell-based tissue engineer⁃
ing by means of inflammatory cells［J］.J Oral Implantol，2014，40（6）：679-689.
［8］REINKE J M，SORG H.Wound repair and regeneration［J］.Eur Surg Res，2012，49（1）：35-43.
［9］FUJIOKA-KOBAYASHI M，MIRON R J，HERNANDEZ M，et al.Optimized platelet-rich fibrin with the low-speed concept：growth factor release，biocompatibility，and cellular response
［J］.J Periodontol，2017，88（1）：112-121.
［10］MICHAEL T.Guided bone regeneration（GBR）using cortical bone pins in combination with leukocyte-and platelet-rich fibrin（L-PRF）［J］.Compend Contin Educ Dent，2014，35（3）：192-198.
［11］DING Y，CUI L，ZHAO Q，et al.Platelet-rich fibrin accelerates skin wound healing in diabetic mice［J］.Ann Plast Surg，2017，79（3）：e15-e19.
［12］NATARAJAN D M，RAO K D.Improving gingival zenith in a unilateral cleft patient using Platelet-Rich Fibrin（PRF）［J］.J
Oral Biol Craniofac Res，2018，8（3）：182-187.
［13］DINH T，BRAUNAGEL S，ROSENBLUM B I.Growth factors in wound healing：the present and the future［J］.Clin Podiatr Med
Surg，2015，32（1）：109-119.
［14］BEHM B，BABILAS P，LANDTHALER M，et al.Cytokines，chemokines and growth factors in wound healing［J］.J Eur Acad
Dermatol Venereol，2012，26（7）：812-820.
［15］KOBAYASHI E，FLUCKIGER L，FUJIOKA-KOBAYASHI M，et al.Comparative release of growth factors from PRP，PRF，and
advanced-PRF［J］.Clin Oral Investig，2016，20（9）：2353-2360.［16］BAGDADI KEL，KUBESCH A，YU X，et al.Reduction of rela⁃tive centrifugal forces increases growth factor release within solid
platelet-rich-fibrin（PRF）-based matrices：a proof of concept of
LSCC（low speed centrifugation concept）［J］.Eur J Trauma
Emerg Surg，2019，45（3）：467-479.
［17］DOHAN EHRENFEST D M，PINTO N R，PEREDA A，et al.
The impact of the centrifuge characteristics and centrifugation pro⁃
tocols on the cells，growth factors，and fibrin architecture of a leu⁃
kocyte-and platelet-rich fibrin（L-PRF）clot and membrane［J］.
Platelets，2018，29（2）：171-184.（收稿日期：2020-10-11）
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