红参调控DARS-
AS1/miR-125a-5p通路对人血管
平滑肌细胞生物学过程的影响
黄达民，张金春，宋蕾，岳冬梅，刘洪强，卢英民
摘要：目的探讨红参是否通过调控DARS-AS1/miR-125a-5p通路从而抑制人血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭㊂方法体外培养人血管平滑肌细胞，同型半胱氨酸(Hcy)处理细胞建立模型，使用不同剂量的红参处理细胞；四唑盐(MTT)进行血管平滑肌细胞增殖检测;Transwell小室实验进行迁移及侵袭检测；实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测DARS-AS1㊁miR-125a-5p的表达量;Hcy诱导的细胞中分别转染si-DARS-AS1㊁pcDNA-DARS-AS1，检测细胞增殖㊁迁移及侵袭；双荧光素酶报告实验检测DARS-AS1㊁miR-125a-5p的靶向关系㊂结果Hcy可增高血管平滑肌细胞增殖率㊁迁移细胞数㊁侵袭细胞数，促进DARS-AS1表达，抑制miR-125a-5p表达(P<0.05)；红参可降低细胞增殖率，减少迁移细胞数㊁侵袭细胞数，抑制DARS-AS1表达，促进miR-125a-5p表达(P<0.05)，且呈剂量依赖性；干扰DARS-AS1表达可抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭；双荧光素酶报告实验证实DARS-AS1可靶向结合miR-125a-5p;DARS-AS1过表达以减弱红参对Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭的抑制作用㊂结论红参可能通过调控DARS-AS1/miR-125a-5p通路从而抑制血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭㊂
关键词：动脉粥样硬化；人血管平滑肌细胞；红参;DARS-AS1;miR-125a-5p
d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2022.23.009
Effects of Red Ginseng on Biological Processes of Human Vascular Smooth Muscle Cells by Regulating DARS-AS1/miR-125a-5p Pathway
HUANG Damin,ZHANG Jinchun,SONG Lei,YUE Dongmei,LIU Hongqiang,LU Yingmin
Chongming Branch of Xinhua Hospital Affiliated to Medical College of Shanghai Jiaotong University,Shanghai202150,China Corresponding Author:LU Yingmin,E-mail:******************
Abstract:Objective To investigate whether red ginseng inhibits the proliferation,migration and invasion of human vascular smooth muscle cells by regulating the DARS-AS1/miR-125A-5P pathway.Methods Human vascular smooth muscle cells were cultured in vitro and treated with homocysteine(Hcy)to establish the model.The proliferation of vascular smooth muscle cells was detected by tetrazolium salt(MTT).Transwell chamber assay was used to detect migration and invasion.Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to detect the expression of DARS-AS1and miR-125a-5p.The Hcy induced cells were transfected with si-DARS-AS1and pcDNA-DARS-AS1,respectively,and the proliferation,migration and invasion of the cells were detected by the above methods.Dual luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between DARS-AS1and miR-125A-5p.Results Hcy could increase the proliferat
ion rate,the number of migrating cells,and the number of invading cells, promote the expression of DARS-AS1,and inhibit the expression of miR-125a-5p(P<0.05).Red ginseng could reduce the cell proliferation rate,reduce the number of migrating cells and invading cells,inhibit the expression of DARS-AS1,and promote the expression of miR-125a-5p(P<0.05)in a dose-dependent manner.Interference of DARS-AS1expression could inhibit Hcy induced proliferation,migration and invasion of human vascular smooth muscle cells.Dual luciferase reporter assay confirmed that DARS-AS1 could target miR-125A-5p.DARS-AS1overexpression could attenuate the inhibitory effect of red ginseng on Hcy induced proliferation, migration and invasion of human vascular smooth muscle cells.Conclusion Red ginseng may inhibit the proliferation,migration and invasion of vascular smooth muscle cells by regulating the DARS-AS1/miR-125a-5P pathway.
Keywords:atherosclerosis;human vascular smooth muscle cells;red ginseng;DARS-AS1;miR-125a-5p
作者单位上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院(上海202150)
通信作者卢英民,E-mail:******************
引用信息黄达民，张金春，宋蕾，等.红参调控DARS-AS1/miR-125a-5p通路对人血管平滑肌细胞生物
学过程的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2022,20(23):4282-4287.
动脉粥样硬化是促使心脑血管疾病发生的重要病
理基础之一，动脉粥样硬化的发生率逐年升高，研究显
示，血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及炎症反应与动脉粥样
硬化密切相关[1-2]㊂因而，积极探寻调控血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭的有效药物对心脑血管疾病的治
proliferation疗具有重要意义㊂同型半胱氨酸(Hcy)可诱导血管平
滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭从而促进动脉粥样硬化的
发生，因此，常采用Hcy诱导血管平滑肌细胞建立模
型[3]㊂红参(red ginseng,RG)具有抗氧化作用，从而可减缓多种疾病的发展进程[4]㊂但红参对血管平滑肌细胞损伤的作用机制尚未明确㊂长链非编码RNA DARS-AS1(LncRNA DARS-AS1)在甲状腺癌等肿瘤中表达上调，并可促进肿瘤的发生及发展[5]㊂但DARS-AS1对血管平滑肌细胞损伤的作用机制尚
未阐明㊂生物信息学分析显示，微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)可能是DARS-AS1的靶基因，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人血管平滑肌细胞中miR-125a-5p的表达下调，上调其表达可通过靶向调控(NLRP3)的表达从而抑制细胞增殖[6]㊂但红参是否可通过调控DARS-AS1/miR-125a-5p通路而影响血管平滑肌细胞生物学行为尚未可知㊂因此，本研究采用Hcy处理人血管平滑肌细胞，探讨红参对细胞增殖㊁迁移及侵袭的影响，探究其对DARS-AS1/miR-125a-5p通路的调控作用㊂1材料与方法
1.1实验试剂红参购自上海齐一生物公司；人血管
平滑肌细胞购自美国ATCC公司;Hcy与四唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；反转录与荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测试剂盒购自美国Thermo Fisher 公司;DARS-AS1小分子干扰RNA(DARS-AS1siRNA, si-DARS-AS1)㊁siRNA阴性序列(si-NC)㊁miR-125a-5p mimics及mimic阴性序列(miR-NC)购自广州锐博生物公司;pcDNA3.1购自上海柯雷生物公司；兔抗人CyclinD1㊁基质金属蛋白酶(MMP)-2㊁MMP-9㊁p21抗体购自美国CST公司；二抗购自美国Abcam公司㊂1.2实验分组 ①红参提取液[7]：称量3g红参样品，磨碎，加入20mL水，超声提取30min，室温条件下10000r/min离心10min，收集3次提取液，使用0.22μm滤膜过滤，加入培养基稀释成浓度5mg/mL㊁10 mg/mL㊁20mg/mL的溶液㊂②血管平滑肌细胞接种于6孔板(5ˑ104个/孔)，分别加入含有500μmol/L Hcy 的培养基处理24h[8]，作为Hcy组㊂同时将正常培养的细胞作为Control组㊂分别加入含有5mg/mL㊁10 mg/mL㊁20mg/mL的红参提取液与500μmol/L Hcy的培养基处理24h，分别作为Hcy+RG-L组㊁Hcy+RG-M 组㊁Hcy+RG-H组㊂后续实验
设置Hcy+si-NC组(si-NC转染至血管平滑肌细胞，加入含有浓度为500μmol/L Hcy的培养基处理24h)㊁Hcy+si-DARS-AS1组(si-DARS-AS1转染至血管平滑肌细胞，加入含有浓度为500μmol/L Hcy的培养基处理24h)㊁Hcy+RG-H+pcDNA组(pcDNA转染至血管平滑肌细胞，加入含有浓度为20mg/mL红参提取液与500μmol/L Hcy 的培养基处理24h)㊁Hcy+RG-H+pcDNA-DARS-AS1组(pcDNA-DARS-AS1转染至血管平滑肌细胞，加入含有浓度为20mg/mL红参提取液与500μmol/L Hcy的培养基处理24h)㊂
1.3观察指标检测
1.3.1MTT法检测细胞增殖情况在96孔板上接种血管平滑肌细胞(1ˑ104个/孔)，按照MTT试剂盒说明书操作并检测细胞OD值㊂
1.3.2Transwell实验检测细胞迁移与侵袭情况在Transwell小室(美国Corning公司)下室加入600μL 含有10%胎牛血清的培养液;Matrigel基质胶包被(侵袭实验，迁移实验无需包被)上室后加入血管平滑肌细胞悬浮液150μL，培养24h后依次以多聚甲醛㊁0.1%结晶紫染液固定20min㊁染10min，于显微镜下观察透过膜的血管平滑肌细胞数㊂
1.3.3实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测细胞中DARS-AS1㊁miR-125a-5p表达水平用1mL Trizol裂解液提取血管平滑肌细胞中总RNA，按反转录试剂盒的说明进行RNA反转录，合成cDNA㊂qRT-PCR反应在StepOne Plus Real-time PCR系统上按照荧光定量PCR试剂说明书操作，通过2-ΔΔC
t法计算DARS-AS1㊁miR-125a-5p表达㊂引物由上海生工公司制备㊂
1.3.4双荧光素酶报告基因检测DARS-AS1与miR-125a-5p 的靶向关系构建野生型载体WT-DARS-AS1与突变型载体MUT-DARS-AS1，分别将miR-NC㊁miR-125a-5p mimics与WT-DARS-AS1㊁MUT-DARS-AS1共转染至血管平滑肌细胞,24h后在双荧光素酶报告分析系统中测量血管平滑肌细胞的相对荧光素酶活性㊂
1.3.5蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测CyclinD1㊁MMP-2㊁MMP-9㊁p21蛋白表达血管平滑肌细胞在蛋白裂解液中裂解，等量蛋白用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，随后将分离的蛋白凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2h，分别加入兔抗人CyclinD1㊁MMP-2㊁MMP-9㊁p21一抗稀释液(均为1ʒ1000),4ħ孵育24h，加入二抗稀释液
(1ʒ2000),37ħ孵育1h，条带使用增强化学发光法可视化后用Image J软件分析㊂
1.4统计学处理采用SPSS21.0软件进行数据分析㊂符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示，采用独立样本t检验及单因素方差分析㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖
与Control组比较,Hcy组细胞增殖率和CyclinD1蛋白水平升高,p21蛋白水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Hcy组比较,Hcy+RG-L组㊁Hcy+RG-M 组㊁Hcy+RG-H组细胞增殖率和CyclinD1蛋白水平降低,p21蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且Hcy+RG-L组㊁Hcy+RG-M组㊁Hcy+RG-H组组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见图1㊁表1㊂
图1Western Blot法检测CyclinD1㊁
p21蛋白表达条带图
表1红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖(xʃs)
组别样本量增殖率(%)CyclinD1p21 Control组90.00ʃ0.000.38ʃ0.070.99ʃ0.04
Hcy组985.61ʃ3.13①0.98ʃ0.05①0.31ʃ0.04①Hcy+RG-L组959.94ʃ1.84②0.78ʃ0.05②0.43ʃ0.04②Hcy+RG-M组933.45ʃ4.90②③0.58ʃ0.06②③0.61ʃ0.08②③Hcy+RG-H组921.94ʃ4.53②③④0.49ʃ0.01②③④0.81ʃ0.09②③④Hcy组与Control组比较,①P<0.05；与Hcy组比较,②P<0.05；与Hcy+RG-L组比较,③P<0.05；与Hcy+RG-M组比较,④P<0.05㊂
2.2红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞迁移㊁侵袭及MMP-2㊁MMP-9蛋白表达与Control组比较, Hc
y组迁移及侵袭细胞数㊁MMP-2㊁MMP-9蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Hcy组比较,Hcy+RG-L组㊁Hcy+RG-M组㊁Hcy+RG-H组迁移㊁侵袭细胞数㊁MMP-2㊁MMP-9蛋白水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，且Hcy+RG-L组㊁Hcy+ RG-M组㊁Hcy+RG-H组组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见表2㊁图2㊁图3㊂
表2红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞迁移及侵袭(xʃs)
组别样本量迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)MMP-2蛋白MMP-9蛋白Control组941.67ʃ11.1245.00ʃ7.700.32ʃ0.090.33ʃ0.09 Hcy组9118.89ʃ8.01①132.11ʃ6.31①0.96ʃ0.09①  1.01ʃ0.05①Hcy+RG-L组9103.11ʃ5.62②104.00ʃ7.70②0.74ʃ0.05②0.82ʃ0.10②Hcy+RG-M组983.11ʃ9.80②③85.67ʃ8.50②③0.58ʃ0.06②③0.60ʃ0.07②③Hcy+RG-H组960.00ʃ6.22②③④63.67ʃ3.20②③④0.44ʃ0.03②③④0.45ʃ0.04②③④Hcy组与Control组比较,①P<0.05；与Hcy组比较,②P<0.05；与Hcy+RG-L组比较,③P<0.05；与Hcy+RG-M组比较,④P<0.05㊂
图2红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞迁移及侵袭图图3各组MMP-2㊁MMP-9蛋白
表达条带图
2.3红参调控DARS-AS1㊁miR-125a-5p的表达与Control组比较,Hcy组DARS-AS1的表达水平升高, miR-125a-5p的表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Hcy组比较,Hcy+RG-L组㊁Hcy+RG-M组㊁Hcy+RG-H组DARS-AS1的表达水平降低,miR-125a-5p的表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且Hcy+RG-L组㊁Hcy+RG-M组㊁Hcy+ RG-H组组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见表3㊂
表3红参调控DARS-AS1㊁miR-125a-5p的表达(xʃs)
组别样本量DARS-AS1miR-125a-5p Control组9  1.00ʃ0.01  1.00ʃ0.01
Hcy组9  2.53ʃ0.61①0.26ʃ0.07①
Hcy+RG-L组9  1.76ʃ0.06②0.49ʃ0.08②
Hcy+RG-M组9  1.58ʃ0.06②③0.74ʃ0.06②③
Hcy+RG-H组9  1.20ʃ0.14②③④0.89ʃ0.03②③④Hcy组与Control组比较,①P<0.05；与Hcy组比较,②P<0.05；与Hcy+RG-L组比较,③P<0.05；与Hcy+RG-M组比较,④P<0.05㊂
2.4干扰DARS-AS1表达抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭Hcy+si-DARS-AS1组细胞
增殖率及CyclinD1㊁MMP-2㊁MMP-9蛋白表达水平，迁移细胞数，侵袭细胞数比Hcy+si-NC组减少, p21蛋白表达水平比Hcy+si-NC组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)㊂详见表4㊁图4㊂
表4干扰DARS-AS1表达抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖㊁
迁移及侵袭及CyclinD1㊁MMP-2㊁MMP-9㊁p21蛋白表达比较(xʃs)
组别样本量DARS-AS1增殖率(%)CyclinD1蛋白p21蛋白Hcy+si-NC组9  2.56ʃ0.3787.92ʃ13.410.97ʃ0.030.31ʃ0.05 Hcy+si-DARS-AS1组90.62ʃ0.09①61.27ʃ13.69①0.39ʃ0.07①0.76ʃ0.06①组别迁移细胞数(个)侵袭细胞数(个)MMP-2蛋白MMP-9蛋白Hcy+si-NC组119.22ʃ2.73135.22ʃ8.980.96ʃ0.05  1.01ʃ0.05 Hcy+si-DARS-AS1组63.00ʃ9.66①57.33ʃ10.31①0.36ʃ0.04①0.42ʃ0.12①与Hcy+si-NC组比较,①P<0.05㊂
图4干扰DARS-AS1表达后CyclinD1㊁
MMP-2㊁MMP-9㊁p21蛋白表达条带图
2.5DARS-AS1靶向调控miR-125a-5p DARS-AS1与miR-125a-5p存在结合位点，详见图5㊂miR-125a-5p过表达能够降低WT-DARS-AS1的荧光素酶活性，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表5㊂DARS-AS1可负向调控miR-125a-5p的表达，差异有统计学意义(P<0.05)㊂详见表6㊂
图5DARS-AS1与miR-125a-5p互补的核苷酸序列示意图
表5双荧光素酶报告实验(xʃs)
组别样本量WT-DARS-AS1MUT-DARS-AS1 miR-NC组9  1.03ʃ0.02  1.02ʃ0.04 miR-125a-5p组90.54ʃ0.12  1.03ʃ0.02
P<0.05>0.05
表6 DARS -AS1靶向调控miR -125a -
5p 的表达(x ʃs )  组别样本量miR -125a -5p si -NC 组9  1.00ʃ0.02si -DARS -AS1组9  1.92ʃ0.30①
pcDNA 组
9  1.00ʃ0.01pcDNA -DARS -AS1组9
0.36ʃ0.11②
①与si -NC 组比较,P <0.05;②与pcDNA 比较,
P <0.05㊂2.6 DARS -
AS1过表达可减弱红参对Hcy 诱导的人血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭的抑制作用 Hcy +RG -H +pcDNA -DARS -AS1组细胞增殖率和CyclinD1㊁MMP -2㊁MMP -9蛋白水平,
迁移细胞数与袭细胞数高于Hcy +RG -H +pcDNA 组，差异均有统计学意义(P <0.05),p21蛋白㊁miR -125a -5p 水平低于Hcy +RG -H +pcDNA 组，差异均有统计学意义(P <0.05)㊂详见图6㊁表7㊂
图6 DARS -AS1靶向调控后CyclinD1㊁MMP -2㊁MMP -
9㊁p21蛋白表达条带图表7 DARS -AS1过表达可减弱红参对Hcy 诱导的人血管平滑肌细胞增殖㊁迁移㊁侵袭的抑制作用及调控CyclinD1㊁MMP -2㊁MMP -9㊁p21蛋白表达(x ʃs )    组别
样本量DARS -AS1miR -125a -5p 增殖率(%)CyclinD1蛋白Hcy +RG -H +pcDNA 组9  1.20ʃ0.04
0.89ʃ0.05
21.48ʃ6.240.49ʃ0.03Hcy +RG -H +pcDNA -DARS -
AS1组9
2.84ʃ0.50①0.41ʃ0.14①
43.68ʃ5.43①
0.68ʃ0.05①    组别p21蛋白
迁移细胞数(个)侵袭细胞数
(个)
MMP -2蛋白MMP -9蛋白Hcy +RG -
H +pcDNA 组0.81ʃ0.06
59.00ʃ3.8763.00ʃ2.65
0.43ʃ0.040.45ʃ0.05Hcy +RG -H +pcDNA -DARS -
AS1组0.48ʃ0.09①
83.22ʃ6.24①
78.89ʃ6.25①
0.69ʃ0.04①
0.58ʃ0.05①
与Hcy +RG -H +pcDNA 组比较,①P <0.05㊂
3 讨 论
红参在血管系统疾病等多种疾病中均具有一定作用，可通过促进一氧化氮(NO )的合成及释放从而
发挥舒张血管的作用[
9]
㊂红参提取物中红参皂苷还可抑制氧化应激反应从而保护神经细胞[
10]
㊂本研究结果显示,Hcy 处理后血管平滑肌细胞增殖能力增强，并可促进CyclinD1表达及抑制p21表达，而不同浓度的红参处理后血管平滑肌细胞增殖能力降低，并可抑制CyclinD1表达及促进p21表达㊂研究表明，下调CyclinD1表达及上调p21表达可抑制血管平滑肌细
胞增殖[11]
，提示红参可抑制Hcy 诱导的血管平滑肌细
胞增殖，且呈剂量依赖性㊂血管平滑肌细胞迁移及侵
袭与MMP -2㊁MMP -
9表达密切相关[12]
㊂本研究结果显示,Hcy 处理后可促进细胞迁移㊁侵袭及MMP -2㊁MMP -9表达，而不同浓度的红参可抑制细胞迁移㊁侵袭及MMP -2㊁MMP -
9的表达㊂  本研究结果显示,
Hcy 诱导的血管平滑肌细胞中DARS -AS1的表达水平明显升高，而不同浓度的红参处理后DARS -AS1的表达水平明显降低，提示红参可能通过调控DARS -AS1的表达从而影响血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭㊂研究指出,DARS -AS1在卵巢癌中表达水平升高，并可能通过靶向调控miR -532-3p 从而促进卵巢癌的发生及发展[
13]
㊂本研究结果显示，干扰DARS -AS1的表达使Hcy 诱导的血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭能力减弱，提示DARS -AS1可促进Hcy 诱导的血管平滑肌细胞增殖㊁迁移及侵袭㊂本研究证实DARS -AS1可靶向结合miR -125a -5p ㊂Hcy 诱导的血管平滑肌细胞中miR -125a -5p 的表达水平降低，而不同浓度的红参处理后miR -125a -5p 的表达水平升高，提示红参可能通过上调miR -125a -5p 的表达从而参与动脉粥样硬化的发生过程㊂研究表明，干扰LnRNA MEG3表达可能通过上调miR -125a -5p 的表

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