中国细胞生物学学报Chinese Journal of Cell Biology 2021，43(3): 531-537DOI: 10.11844/cjcb.2021.03.0005
作为miR-93新的靶基因抑制前列腺癌细胞
增殖、侵袭和迁移
杨旭1谢辉M林平1于晓光
G哈尔滨医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，哈尔滨150081;
2哈尔滨医科大学基础医学院生物技术实验中心，哈尔滨150081)
摘要 该文探讨了沿作为m iR-93新的靶基因对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。采用重组质粒pcD N A3.1-S I K l上调前列腺癌细胞中S I K1的表达后，利用C C K8和克 隆形成实验检测细胞增殖；利用细胞划痕和T ran sw ell实验检测细胞侵袭和迁移；利用W est­
ern blot检测 E-cadherin和 Vimentin的蛋白表达。采用生物信息学方法预测把向57A7 m RNA
的;V U T R的m iR N A s并进行筛选；双焚光素酶报告实验和Western blot验证m iR-93起向调控 57A：/。结果显示，上调S IK1的表达能抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并增加E-cadherin
和减少Vim entin蛋白表达；m iR-93能够靶向负调控总之，5/幻可作为m iR-93—个新的 靶基因抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。
关键词前列腺癌；见尺/;miR-93；细胞增殖；细胞侵袭和迁移
S IK1, As a New Target Gene of miR-93, Inhibits the Proliferation,
Invasion and Migration of Prostate Cancer Cells
YANG Xu1,XIE Hui K2,LIN Ping1,YU Xiaoguang1*
Department o f B iochemistry and Molecular Biology, Basic Medicine College, Harbin Medical University, Harbin 150081, China;
2Biotechnology Experimental Center, Basic Medicine College, Harbin Medical University, Harbin 150081, China)
Abstract This paper investigated the inhibitory effect o f SIK1,as a new target gene o f m iR-93, on the proliferation,invasion and migration of prostate cancer cells.After the expression o f S IK1in prostate cancer cells was up-regulated by recombinant plasmid pcDNA3.1-S I K l,C C K8 and clone f
ormation assay were used to detect cell proliferation;cell invasion and migration was detected by cell scratches and Tran-swell assay;the protein expression levels o f E-cadherin and Vimentin were detected by Western blot.Lucif-erase reporting experiment and Western blot verified the targeted regulation o f SIK1by m iR-93. The results showed that up-regulated S IK1could inhibit the proliferation,invasion and migration o f prostate cancer cells,as well as increase E-cadherin protein expression and decrease Vimentin protein expression;m iR-93 could negatively regulate SIK1.In conclusion,SIK1can act as a new target gene o f m iR-93 to inhibit the proliferation,invasion and migration of prostate cancer cells.
Keywords prostate cancer;SIK1;miR-93; cell proliferation;cell invasion and migration
收稿日期:2020-11-14 接受日期:202(M2-21
省属高校基础研宂基金(批准号:2018-KYYW F-0432)资助的课题
*通讯作者。Tel: 189****7534,E-mail: yuxg@hrbmu.edu
Received: November 14,2020 Accepted: December 21，2020
This work was supported by the Fundamental Research Funds for the Provincial Universities (Grant
No.2018-KYYWF-0432)
♦Correspondingauthor.Tel:+86-189********,E-mail:**************
URL: /arts.asp7icN5481
532•研宄论文•
前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性生殖系统 最常见的恶性疾病，是目前男性中最主要的致死肿 瘤。其发病率随年龄而增长，有明显的地区差异【11。阐明前列腺癌细胞的增殖和迁移的分子机制，有助 于了解前列腺癌的发病机制和进展，为有效前 列腺癌提供新的靶点。
盐诱导激酶 l(salt inducible kinase 1，S IK1)是 一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为A M P活化蛋白激 酶（AM P activated protein kinase,A M PK)家族成员 之一[2]。肝脏激酶Bl(liver kinase B l，L K B1)是S IK1的上游激酶[3]。S IK1参与多种肿瘤的发生发展，有 文献报道，卵巢癌(ovarian cancer, 0C)中L K B1上调 能促进S IK1的表达进而抑制卵巢癌细胞扩散[41。还 有研宄表明，S I K1在肝癌细胞中的上调显著抑制 了异种移植瘤模型的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肿瘤生长和肺转移 [5]。S IK1能受到胃泌素的调节，影响胃泌素诱导的胃腺 癌细胞信号转导，抑制胃癌细胞的迁移[6)。在成神经 管细胞瘤(medulloblastoma,M B)中，miR-130b-3p通 过p53信号通路靶向见尺/，从
而抑制成神经管细胞瘤 的发生m。然而，经PubMed检索发现,S IK1在前列腺 癌中的作用尚未见相关文献报道。
m iRN As(m icroRNAs)是一类调节基因表达的 小的非编码RNA(18~25个核苷酸)m。它们在转录后 通过翻译抑制或m RNA降解负调控特定m RNA的蛋 白表达[91。多种m iRN As能靶向并负调控5/欠/的表 达进而影响多种癌症的发生发展。例如，在上皮性 卵巢癌中，沉默miR-141可以恢复5/尺/的表达，抑制 卵巢癌细胞的增殖[|()]；在结直肠癌(colorectal cancer，C R C)中，miR-17能通过靶向抑制肿瘤侵袭和迁移【11]；在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarci­noma,PDA)中，5/尺；的过表达抑制 miR-203 介导的对 胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的调控[12)。那么，在 前列腺癌中是否存在新的m iRN A靶向负调控*5/尺7 的表达进而影响前列腺癌细胞的功能呢？因此，本课 题进一步利用 miRandaChttpV//mi-croma/home.do)、TargetScan(www.targetscan. org)和 P icTar(pictar.mdc-berlin_de/)这 3个数据库 预测靶向紐W的m iRNAs。经预测得知,miR-93能够 靶向57A7 m RNA的30JT R。
因此，本研宄探讨了作为miR-93新的靶基因 对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用，旨在为前列腺癌的分子诊断和预后预测提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞系 人类正常前列腺细胞系RWPE-1细
胞和人前列腺癌相关细胞系PC3和DU145购于中国 医学科学院细胞中心。
1.1.2主要试剂 RPMI 1640培养基、DMEM培养基、OPTI-MEM培养基和FBS购自美国Hyclone公司；青霉素-链霉素溶液和PBS购自生工生物工程(上海）股份有限公司；重组质粒pcDNA3.1-S IK l和psi-check2 质粒购自金唯智生物科技有限公司；Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Trizol和逆转 录试剂盒购自日本TaKaRa公司；S IK1抗体购自美国 Abeam公司；蛋白 Marker、Vimentin抗体和 E-cadherin 抗体购自美国Cell Signaling公司；GAPDH抗体购自北 京中杉金桥生物技术有限公司；磷酸酶抑制剂购自上 海碧云天生物技术有限公司；蛋白酶抑制剂购自瑞士 Roche公司；CCK8试剂盒购自日本Dojindo公司；Tran-swell培养系统购自美国Thermo公司；SIK1和GAPDH 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；miR-93引物、U6引物和miR-93 inhibitor由广州市锐博生物 科技有限公司合成。
1.2方法
1.2.1细胞培养前列腺癌细胞DU145用含10% FB S、1%青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基培 养；
前列腺癌细胞PC3用含15%F B S、1%青霉素-链 霉素溶液的DMEM培养基，于37 °C、5%C02条件下 培养。观察细胞生长情况，约2天换液，约3天传代，取 生长状态良好的对数生长期细胞进行实验。
1.2.2细胞转染 将前列腺癌细胞以每孔5><1〇5个铺于6孔板内，过夜培养，待细胞密度达到70%时进 行转染。按照Lipofectamine 3000说明书步骤分别转 染重组质粒pcDNA3.1-S I K l和空质粒，每孔转染终 浓度为1 〇〇〇nmol/L，24 h或者48 h后收集细胞进行 后续实验；以相同的方法转染miR-93 inhibitor和阴 性对照。miR-93 inhibitor和阴性对照的序列见表1。
1.2.3 CCK8实验将己经转染的细胞消化后，稀释 10倍计数，每100 HL细胞原液含2><1〇3个细胞，同时加 入等体积(100 ^L)的细胞培养基做空白对照；每孔加 入10队CCK8溶液；置于37 °C、5%C02条件下继续 孵育0.5~4 h，对于大多数情况孵育1h 即可。时间的
丰易;15等:5/尺/作为miR-93新的靶基因抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁秫533
长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定, 初次实验时可以在0.5、1、2和4 h后分别用酶标仪 检测，然后选取吸光度(£>)范围比较适宜的一个时间 点用于后续实验；在450 nm波长处测定吸光度，连续 测定4天的吸光度值。
1.2.4克隆形成实验 细胞转染后，次日取处于对数生长期的细胞，经胰酶消化，然后将细胞悬液转移
到1.5mL EP管中混匀，取100队细胞悬液稀释10倍 进行细胞计数，最后稀释到所需要细胞浓度；按照 200个/孔的细胞浓度接种于6孔板，每3天观察及换 液1次，克隆10天左右，于倒置显微镜下可以观察到 明显的克隆团，大约每个细胞团50个细胞。吸出所 有的培养基，并用PB S洗2次。先用4%的多聚甲醛固 定15 min，然后用0.1%结晶紫染15 min，再用自来 水冲洗，待干燥后进行拍照，最后对克隆细胞团计数 并进行统计学分析。
1.2.5细胞划痕实验 先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，每隔0.5~1 cm—道，横 穿过孔。每孔至少穿过5条线；在孔中加入约5M05个细胞(具体数量因细胞不同而不同)，接种原则为 过夜能铺满皿底；第2天用头比着直尺，尽量垂直 于背后的横线划痕；用PBS洗细胞1~3次，洗净划下 的细胞，加入无血清培养基；放入37 °C、5% (：02培 养箱中培养。分别在0和24 h取样进行拍照并记录实验结果。
1.2.6 Transwell实验 在24孔板中加入600 gL含 15%F B S的DMED培养基，平稳地将小室放入，将 200 pL细胞悬液(细胞密度为2 x1〇5个/mL)滴加到小 室里面，在37 °C、5% (：02恒温培养箱孵育24 h后将 小室取出，轻柔地用PBS清洗，接着用4%多聚甲醛固 定20 min，之后用棉签擦去上层未穿过细胞，PBS清 洗后用结晶紫染15 min，自来水冲洗染料后将小室 放入37 °C烘箱干燥，最后在倒置显微镜下拍照计数。
1.2.7 qRT-P C R实验 Trizol法提取转染空质粒 组和重组质粒pcD N A3.1-S I K l组的前列腺癌细胞 DU145和PC3中的总RNA，取1n g R N A用茎环法逆 转录成cDNA后，用qRT-PC R检测S/尺/的m RNA水 平，GZPZ)//作为内参；Trizol法提取转染阴性对照和 miR-93 inhibitor的前列腺癌细胞D U145和PC3中的 总RN A，逆转录成cDNA后用qRT-PCR检测阴性对照 组和 miR-93 inhibitor组 S/A7的mRNA水平，W5作为 内参。引物序列见表2。
1.2.8 Western blot收集转染后48 h的前列腺癌细 胞，提取细胞总蛋白质，B C A法检测蛋白质的浓度，经10。/。的SDS-PAGE分离，然后在丨000 mA恒流下进 行湿转，将蛋白质转移到PVDF膜上，封闭液室温封 闭2h后，加入一抗(S IK1、Vimentin、E-cadherin—抗 稀释比例分别为1:500、1:1 000、1:1 000)，在4 °C孵
miRNA
miR-93 inhibitor NC inhibitor
表1miRNA抑制剂序列proliferation
Table 1miRNA inhibitor sequence
序列(5%3f)
Sequence (5’—3’）
CUG UUC CUG CUG AAC UGA GCC A
CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA
表2引物序列
Table 2 Primer sequences
基因名称 Gene name 序列(5，一3，) Sequence (5’—3’)
miR-93Forward: TGC GGT TTG GCA CTA GCA CAT
Reverse: CCA GTG CAG GGT CCG AGG T
U6Forward: GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAT
Reverse: CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT SIK1Forward: GTC CCT CGG AAG GAA CTA GC
Reverse: CTC GCG TTT TTC CTT AGC TG
G A P D H Forward: CAG CGA CAC CCA CTC CTC
Reverse: TGA GGT CCA CCA CCC TGT
534•研宂论文•
育过夜，第2天用TBST 洗去游离抗体，加入HRP 标记 的山羊抗小鼠或兔IgG 二抗(1:1 000)，室温孵育1.5 h ，
T BST 洗膜3次，每次10 min , EC L 发光液显。
1.2.9双荧光素酶报告基因实验 miRanda 数据库中显示了S //：/与miR -93的结合位点，将包含了结合 位点的57K / 3'U TR 的野生型和突变型片段分别插入 到pSi -C heC k 2报告质粒的多克隆酶切位点区间，利用
Lipofectamine  3000转染试剂将57A 7 30JT R 的野生型
(wt )和突变型(mut )重组质粒分别与miR -93 mimic 或
NC  mimic 共转染进HEK  293T 细胞，海肾荧光素酶作
为底物，48 h 后检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素 酶的活性。1.2.10统计学方法
所有实验重复3次，实验数据
均以平均值±标准误表示。用SPSS  17.0版统计 分析软件中的单因素方差分析(one-way  analysis  of
variance , ANOVA )比较三组及三组以上差异；用r 检
验(f  test )比较两组间差异，尸<0.05表示差异显著且具 有统计学意义。
2结果
2.1上调SIK 1的表达可抑制前列腺癌细胞增殖
qRT -PCR 和 Western  blot 结果（图 1A 和图 1B )显
示，转染重组质粒PCDNA 3.1-S IK 1后，PC 3和D U 145 细胞中S IK 1的m RN A 和蛋白水平显著高于对照组
(尸<0.001)，说明转染成功。如图1C 和图1D ，C C K 8 和克隆形成实验结果所示，上调S I K 1的表达后
PC 3和D U 145细胞的增殖能力均显著低于对照组
(P <0.001)〇
2.2上调SIK 1的表达可抑制前列腺癌细胞侵袭 和迁移
细胞划痕和Transwell 实验结果显示，与对照组 相比转染重组质粒pcDNA 3.1-SIK 1的PC 3和DU 145 细胞的侵袭和迁移能力明显降低（图2A 和图2B )。
Western  blot 实验结果显示，在PC 3和D U 145细胞中
上调S IK 1的表达后，E -cadherin 的蛋白水平升高，而
Vimentin 的蛋白水平降低(图2C )。
2.3筛选靶向的miRNAs
利用 miRanda (http ://www .microma .org /microma /
home .do )、TargetScan (http ://www .targetscan .org)fP PicTar (http ://pictar .mdc-ber  lin .de /)这 3个数据库预测
能够靶向57尺/m RN A 的3'U T R 的m iRNAs 。预测后 取交集得到19个m iR N A s 能够靶向57尺/ m R N A 的 31JTR (图3A )。有研宄表明，miR -93在前列腺癌中高 表达，且发挥肿瘤启动子的作用tl 3]。qRT -PCR 结果 显示，与对照组相比，PC 3和DU 145细胞系中miR -93 的表达均升高(P <0.01, P <0.001)(图3B )。2.4 miR -93靶向负调控SIK 1
qRT -P C R 结果显示，转染miR -93 inhibitor 后,
Time /h Time /h A 、B: qRT-PCR 和Western blot 检测SIK1的过表达效率；C 、D: CCK8和克隆形成实验检测细胞的增殖情况，上调SIK1的表达抑制了细胞增殖。 **尸<0.01，***尸<0.001，与Vector 组相比。A,B- the overexpression efficiency of SIK1 was detected by qRT-PCR and Western blot; C,D: CCK8 and clone formation assay were used to detect cell proliferation, and the up-regulation of SIK1 inhibited cell proliferation. **/,<0.01, ***P<0.001 vs  Vector group.
图1上调SIK1的表达可抑制前列腺癌细胞增殖
Fig.l Up-regulation of SIK1 can
inhibit the proliferation of prostate cancer cells
杨旭等:57尺/作为miR -93新的靶基因抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移535
miR-130a/b miR-20a/b miR-137 miR-301
miR-141 miR-302a/b/c/d miR-142-3p miR-372 miR-148a/b miR-93 miR-152 miR-203
miR-17
A ：韦恩图显示了从数据库(miRanda 、TargetSan 和PicTar)中预测到的靶向分尺/ 3XJTR 的miRNAs; B: qRT-PCR 检测PC3、DU145细胞系和正常前 列腺细胞系中miR-93的表达。••/><0.01，“〒刈別丨，与RWPE-1组相比。
A: Venn diagram shows the miRNAs targeting SIKJ  3'UTR predicted from the databases (miRanda, TargetSan and PicTar); B: the expression of miR- 93 in PC3 and DU145 cell lines and normal prostate cell lines were detected by qRT-PCR. **/><0.01, ***P<0.001 v s  RWPE-1 group.
图3筛选靶向57A7的miRNAs
Fig.3 miRNAs targeting SIK1 are screened
卩匚3和011145细胞中57/^的1111^八水平显著高于对
照组(/><0.001)(图4八)。'^816〇^
丨〇1结果显示，转染
miR -93 inhibitor 后，PC 3和D U 145细胞系中S IK 1 蛋白
质的表达均显著增加（图4B )。miRanda 预测miR -93 在5/尺7 mRNA 的30JT R 上的靶位点和突变位点如图
4C 所示。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR - 93 靶向 见尺/ mRN  A  的 3 TJTR (尸 <0.001)(图 4D ) 。
3讨论
前列腺癌是目前男性中最常见的致死肿瘤。其
(A )
Vector
PC3
DU 145
pcDNA3.1-SIKl
(B )
Vector
■
PC3
pcDNA3.1-SIKl
48 h
(C )
PC3DU 145
135 kDa 57 kDa 34 kDa • . -一. 1
鶴
娜
| | _
_
丨pcDNA3.1-SIKl Vector
E-cadherin Vimentin
GAPDH
卜;,
48 h
A 、B: Transwell 和细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移情况，上调SIK1的表达抑制了细胞侵袭和迁移；C 用重组质粒pcDNA3.1-SIKl 或空质粒 处理PC3和DU145细胞48 h，Western blot 检测E-cadherin 和Vimentin 的蛋白表达情况。
A,B ： Transwell and cell scratch assay detected cell invasion and migration, and the up-regulation o
f SIK1 inhibited cell invasion and migration; C: PC3 and DU145 cells were treated with recombinant plasmid pCDNA3.1-SIKl or empty plasmid for 48 h, and the protein expression levels of E-cadherin and Vimentin were detected by Western blot.
图2上调SIK1的表达可抑制前列腺癌细胞侵袭和迁移
Fig.2 Up-regulation of SIK1 can inhibit the invasion and
migration of prostate cancer cells

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