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现代中药研究与实践2021年第35卷第2期Chin. Med. J. Res. Prac., 2021 V ol. 35 No. 2
基金项目： 国家自然科学基金（81760870）；广西自然科学基金资助项目（2015GXNSFBA139126）；广西卫生计生委自筹经费科研课题（Z2015481、
Z20170303）；广西2018年全国中药特技术传承人才培训项目；广西中医药大学第一附属医院院内制剂研究与开发项目（2018ZJ002）
作者简介：唐爱存（1983—），男，硕士，副主任中药师, 研究方向：中医药防治肝病研究。E -mail:**************通信作者：卢秋玉（1984—），女，硕士，副主任药师，研究方向：中医药防治心血管疾病。E -mail:**************
葫芦茶苷对大鼠肝星状细胞增殖和细胞外基质的影响
及机制研究
唐爱存1, 2，俞　渊1，罗　远1，卢秋玉3*，王　兵1
（1.广西中医药大学第一附属医院 科研部，广西 南宁 530023；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，
广西 南宁 530200；3.广西壮族自治区人民医院 药学部，广西 南宁 530021）
摘　要：目的　研究葫芦茶苷对大鼠肝星状细胞增殖和细胞外基质分泌的影响，并探讨其可能机制。
方法　以大鼠肝星状细胞（HSC-T6）为体外细胞模型，采用CCK-8法检测葫芦茶苷对HSC-T6增殖的抑制作用，ELISA 法测定细胞上清液中Hyp 、HA 和TIMP-1的含量，FQ-PCR 检测Col I 、TGF-β1、α-SMA 、PDGF-BB mRNA 的表达，Western blot 法检测细胞内TGF-β1、α-SMA 和PDGF-BB 蛋白的表达。结果　葫芦茶苷对HSC-T6细胞的增殖有较强的抑制作用。与空白组比较，葫芦茶苷各剂量组能降低细胞上清液中Hyp 、HA 和TIMP-1的含量，下调细胞内Col I 、TGF-β1、α-SMA 、PDGF-BB mRNA 的表达，而且能降低细胞内TGF-β1、α-SMA 和PDGF-BB 蛋白的表达。结论　葫芦茶苷体外具有抗肝纤维化作用，其机制可能是抑制HSC-T6细胞的增殖，下调TGF-β1、α-SMA 和PDGF-BB 蛋白的表达，从而减少肝细胞外基质的合成和沉积。
关键词：
葫芦茶苷；大鼠肝星状细胞；细胞增殖；细胞外基质中图分类号：R285.5          文献标识码： A          文章编号：1673-6427（2021）02-26-04doi: 10.13728/j. 1673-6427. 2021. 02. 007
Effects of Tadehaginoside on Rat Hepatic Stellate Cells Proliferation and Extracellular
Matrix and Its Underlying Mechanism
TANG Ai-cun 1, 2, YU Yuan 1, LUO Yuan 1, LU Qiu-yu 3*, WANG Bing 1
(1. Department of Scientific Research, the First Affiliated Hospital of Guangxi University of TCM, Nanning 530023, China; 2. Guangxi Zhuang Yao Medicine Center of Engineering and Technology, Nanning 530200, China; 3. Department of Pharmacy, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China ）Abstract: Objective  To investigate the potential pharmacological activity of tadehaginoside(TA) on rat hepatic stellate cells proliferation and extracellular matrix and its underlying mechanism. Methods  This experiment established a cell model using rat hepatic stellate cells(HSC-T6), HSC-T6 are cultured in vitro , and CCK-8 assay is used to evaluate the inhibitive effect of TA. The contents of Hyp, HA and TIMP-1 in HSC-T6 cell supernate are detected by ELISA. The relative quantification of Col I, TGF-β1, α-SMA, PDGF-BB mRNA expression in HSC-T6 cell is detected by FQ-PCR. The protein expression of TGF-β1, α-SMA, PDGF-BB related to HSC-LX2 cell cycle by Western Blotting. Results  TA display strong inhibitory action to the proliferation of HSC-T6 cell. Compared with the blank group, the contents of Hyp, HA and TIMP-1 in cell supernate are decreased in each dose group of TA. In addition, TA could down-regulated the expression of Col I, TGF-β1, α-SMA, PDGF-BB mRNA, and the expressions of T
GF-β1, α-SMA and PDGF-BB are all decreased. Conclusion  TA has a anti-hepatic fibrosis effect in vitro , the mechanism may inhibit the proliferation of hsc-t6 cells, and down-regulated expression of TGF-β1, α-SMA and PDGF-BB proteins, thus reduces the synthesis and deposition of the extracellular matrix.
Keywords: Tadehaginoside(TA); rat hepatic stellate cells; cell proliferation; extracellular matrix
肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，现代医学研究发现肝纤维化是由于细胞外基质的增殖与降解失去平衡而导致纤维结缔组织在肝脏内异常沉积的病理过程，肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化形成的最终共同途径，并且是肝纤维化发生发展的关键环节，研究表明HSC的活化和转化在肝纤维化中起着关键作用[1-2]。肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化以及肝癌的必经阶段。目前在诊治方面虽然有一些进展，但仍缺乏确定有效的药物。因此，阻断细胞因子的促增殖作用有望成为肝纤维化的有效措施。
葫芦茶苷是从中草药葫芦茶中提取分离得到的活性成分，前期研究发现[3-6]，葫芦茶苷具有保肝作用，而且体外对乙型肝炎病毒具有很强的抑制作用。本课题组近期研究发现葫芦茶苷对CCl4诱导的小鼠肝纤维化具有明显的保护作用，其机制可能通过清除自由基和炎性反应，抑制胶原合成与沉积，减轻肝星状细胞的活化[7]。为进一步探讨葫芦茶苷在体外的抗肝纤维化作用，本实验以大鼠肝星状细胞
为体外细胞模型，从细胞增殖、细胞外基质的合成和沉积以及相关蛋白的表达方面探讨其可能机制，以期为深入研究开发葫芦茶抗肝纤维化提供理论基础和实验依据。
1　材料
1.1　药品与试剂
葫芦茶苷样品（纯度＞98.0%）由本课题组从葫芦茶Tadehagi triquetrum（L.） Ohashi中分离而得，采用无血清高糖DMEM培养基配成浓度为500 μg/mL 母液， 4℃保存备用。秋水仙碱片（批号：20181001，规格：0.5 mg，广东彼迪药业有限公司）；高糖DMEM培养基（CatNO13200 035，美国Gibco 公司）；胎牛血清（CatNO16000 036，海克隆），胰蛋白酶（美国Amersco公司）；PBS（LotNO40903060T，福州迈新生物技术开发有限公司）；CCK 8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；First Strand cDNA Synthesis Kit （批号：00064478，美国MBI公司）；琼脂糖（批号：17065318，西班牙Biowest公司）；2×PCR TaqMix（批号：9108，日本Takara公司）；RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制剂）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Hyp、HA、TIMP 1检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其它试剂均为分析纯。
1.2　细胞株
HSC T6细胞株购自中国科学院细胞库，为SV40转染SD大鼠HSC，其表型为活化的HSC，表达高水平的I型胶原，本研究室自行培养传代。
1.3　仪器
Model 311型CO2孵箱（美国Thermo Forma公司）；Model 450型自动酶标仪（美国Bio Rad公司）；XD 101型倒置显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；722型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；PAC 300型低压电泳仪﹑ABI 9700型聚合酶链反应（PCR）扩增仪﹑HD 4N型核酸蛋白测定仪（美国Bio Rad公司）；Tanon 5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。
2　方法
2.1　细胞培养
采用含10%胎牛血清的高糖DMEM作为培养液，将HSC T6细胞置CO2培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养，8 h即可贴壁生长，每天观察细胞生长情况，每两天更换一次细胞培养液，细胞长满后，采用0.25%胰酶消化传代。
2.2　CCK 8法检测葫芦茶苷对HSC T6增殖的影响
将对数生长期的HSC T6细胞经0.25% 胰蛋白酶消化后，用完全培养液将细胞浓度调至 1 × 104/mL 细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔200 μL，每个浓度设6个复孔，置CO2孵箱（37 ℃，5% CO2）中培养。24 h 后细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液，加入6个终浓度分别为10、20、40、80、160、320 μg/mL的葫芦茶苷药液，并设置空白对照组，连续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK 8，混匀后培养箱中孵育 2 h，采用自动酶标仪（检测波长为450 nm）读取各孔OD值，并计算不同药物浓度对HSC T6 细胞的增殖抑制率。
2.3　ELISA法检测细胞上清液Hyp、HA 和TIMP 1的含量
将对数生长期的HSC T6细胞接种于96孔培养板中，每孔200 μL，置 CO2孵箱（37 ℃，5% CO2）中培养。24 h 后细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液。分别设置空白对照组、阳性对照组（秋水仙碱 6.25 μg/mL）、葫芦茶苷剂量组（20、40、80 μg/mL），每个浓度设 6 个复孔，置CO2孵箱（37℃，5% CO2）中继续培养24 h后，收集各组细胞上清液，分别按照试剂盒说明书采用ELISA法测定细胞上清液中Hyp、HA和TIMP 1的含量。
2.4　FQ PCR法检测细胞内Col I、TGF β1、α SMA 和PDGF BB mRNA的表达
按照“2.3”项下的细胞分组与给药，连续培养
24 h后，弃去上清液，收集各组细胞，采用 Trizol一步法提取细胞总RNA，再由RNA反转录成 cDNA，进行 qPCR检测，以β actin为内参，各基因引物序列见表1。FQ PCR反应体系为1 μL cDNA模板，10 μL ddH2O，8 μL SYBR Premix Ex TaqTM和上﹑下游引物各0.5 μL，总反应体系为20 μL，并保证所有反应体系的组成（如酶浓度、引物浓度等）一致。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性10 s， 56℃退火20 s，72℃延伸20 s，共反应55个循环，最后在72℃延伸5 min。结果采用比较2-△△CT法分析各基因在细胞中表达的相对含量。
表1　基因引物序列表
Tab. 1　The table of gene primer sequence
名称引物序列
Col I 上游5'-CAACCTCAAGAAGTCCCTGC-3'
Col I 下游5'-AGGTGAATCGACTGTTGCCT-3'
TGF β1 上游5'-ACAGCAACAATTCCTGGCGATAC-3'
TGF β1 下游5'-GCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3'
α SMA上游5'-CGTGGCTACTCCTTCGTG-3'
α SMA下游5'-TGATGACCTGCCCGTCT-3'
PDGF BB 上游5'-CCTCATAGACCGCACCAAC-3'
PDGF BB 下游5'-CTTCTTCCGCACAATCTCG-3'
β actin上游5'-ACACTGTGCCCATCTACG-3'
β actin下游5'-TGTCACGCACGATTTCC-3' 2.5　Western blot 法检测细胞内TGF β1、α SMA 和PDGF BB蛋白的表达
按照“2.3”项下的细胞分组与给药，连续培养24 h后，弃去上清液，收集各组细胞，用RIPA 裂解细胞得总蛋白。采用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白浓度，用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS PAGE）进行蛋白质的电泳分离，然后再转移到硝基纤维素膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭液封闭1 h，分别加入兔抗鼠TGF β1、α SMA 、PDGF BB和内参β actin多克隆抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜 3 次，再加入二抗室温孵育2 h后，用TBST 缓冲液清洗，以ECL显后，置于全自动化学发光图像分析系统上成像。以目标蛋白与内参β actin条带的灰度值比值来表示目标蛋白的表达水平。
2.6　统计学方法
用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3　结果
3.1　葫芦茶苷对HSC T6细胞增殖的影响
与空白组比较，葫芦茶苷各剂量组均能抑制HSC T6细胞的增殖，差异具有统计学意义（P＜0.05
或P＜0.01），且随着给药剂量的增加，肝星状细胞被抑制效果越明显，结果见表2。根据实验结果，以浓度为20、40、80 μg/mL作为后续实验的给药剂量。
表2　葫芦茶苷对HSC T6细胞增殖的影响（x ± s，n ＝ 6）Tab. 2　Effect of Tadehaginoside on the proliferation of HSC T6 cells
（x ± s，n ＝ 6）
组别浓度/（μg/mL）OD值抑制率/%空白对照组-0.557 ± 0.0560
葫芦茶苷
不同剂量组
10 0.483 ± 0.044*13.29 ± 1.56*
20  0.375 ± 0.040**  32.68 ± 3.71**
40  0.326 ± 0.031**  41.47 ± 5.02**
80  0.245 ± 0.017**  56.01 ± 5.97**
160  0.208 ± 0.011**  62.66 ± 6.85**
320  0.192 ± 0.010**  65.53 ± 7.13** F55.25338.655
P  0.005  0.007注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
3.2　葫芦茶苷对细胞上清液Hyp、HA、TIMP 1含量的影响
结果显示，葫芦茶苷各剂量组均能降低HSC T6细胞上清液中Hyp、HA 和TIMP 1的含量，与空白组比
较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），但与秋水仙碱组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），详见表3。
表3　葫芦茶苷对细胞上清液Hyp、HA、TIMP 1含量的影响
（x ± s，n ＝ 6）
Tab. 3　Effect of Tadehaginoside on Hyp, HA and TIMP 1 content in cell
supernatant（x ± s，n ＝ 6）
组别
浓度/
（μg/mL）
Hyp/
（μg/mL）
HA/
（ng/mL）
TIMP 1/
（pg/mL）
空白对照组-11.75 ± 1.82156.34 ± 17.35  2 867.23 ± 182.55秋水仙碱组          6.25    7.36 ± 1.06**  101.62 ± 12.40**    2 369.44 ± 153.25**葫芦茶苷
低剂量组
20  9.42 ± 0.94*    112.03 ± 13.06**    2 641.35 ± 179.47*
葫芦茶苷
中剂量组
40    8.58 ± 0.81**      96.74 ± 10.58**    2 506.77 ± 148.06**
葫芦茶苷
高剂量组
80      6.71 ± 0.90**    87.07 ± 9.64**    2 382.12 ± 137.99**
F35.22730.89924.188
P  0.008  0.009  0.009
注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
3.3　葫芦茶苷对细胞内Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA表达的影响
FQ PCR结果表明，与空白组比较，葫芦茶苷各剂量组能降低HSC T6细胞内Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA的表达，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），但与秋水仙碱组比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见表4。
3.4　葫芦茶苷对细胞内 TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表达的影响
Western blot结果显示，葫芦茶苷各剂量组能下调细胞内TGF β1、α SMA、PDGF BB 蛋白的表达，
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与空白组比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01），但与秋水仙碱组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），详见图1、表5。
表4　葫芦茶苷对细胞内Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA 表
达的影响（x ±s ，n = 6）
Tab. 4　Effects of Tadehaginoside on the expression of Col I, TGF 1,
SMA, PDGF BB mRNA（x ±s ，n = 6）
组别
浓度/
（μg/mL ）
Col I TGF β1
α SMA
PDGF BB
空白对照组
-  1.00 ± 0.05  1.00 ± 0.06  1.00 ± 0.05  1.00 ± 0.08
秋水仙碱组          6.25  0.65 ± 0.09**
0.57 ± 0.08**  0.71 ± 0.09**
0.69 ± 0.10**葫芦茶苷
低剂量组
20  0.87 ± 0.11*  0.80 ± 0.10*  0.90 ± 0.13*  0.85 ± 0.13*葫芦茶苷
中剂量组
40  0.73 ± 0.08**  0.69 ± 0.09**  0.75 ± 0.12*
0.78 ± 0.09*
葫芦茶苷
高剂量组
80  0.58 ± 0.07**  0.60 ± 0.07**  0.66 ± 0.09**  0.59 ± 0.08**
F 85.02375.695
80.05578.951P  0.003  0.004
0.003
0.004
注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01
注：Ⅰ. 空白对照组；Ⅱ. 秋水仙碱组；Ⅲ. 葫芦茶苷低剂量组；Ⅳ. 中剂量组；Ⅴ. 高剂量组
图1　葫芦茶苷对TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表达的影响Fig. 1　Effects of Tadehaginoside on TGF 1, α SMA and PDGF BB
protein expression
表5　葫芦茶苷对TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表达的影响
（x ±s ，n = 6）
Tab. 5　Effects of Tadehaginoside on TGF 1, α SMA and PDGF BB
protein expression（x ±s ，n = 6）
组别浓度/
（μg/mL ）
TGF  β1/β actin α SMA/β actin
PDGF  BB/β actin 空白对照组  -  1.062 ± 0.1550.806 ± 0.106  1.388 ± 0.165秋水仙碱组        6.250.569 ± 0.085**0.529 ± 0.075**0.632 ± 0.079**葫芦茶苷低剂量组200.813 ± 0.011*0.725 ± 0.091*0.827 ± 0.103*葫芦茶苷中剂量组400.601 ± 0.079**
0.624 ± 0.081**
0.753 ± 0.099**葫芦茶苷高剂量组
80
0.578 ± 0.084**
0.591 ± 0.075**
0.665 ± 0.083
**
F 36.81652.93342.186P
0.007
0.005
0.006
注：与空白对照组比较，*
P ＜0.05，**
P ＜0.01
proliferation
4　讨论
目前研究认为肝纤维化主要是由ECM 引起的，ECM 在肝脏中过量产生和沉积，打破了细胞外基质增殖和降解的平衡[8]，其中肝星状细胞（HSCs ）是慢性肝病中ECM 增加的主要来源，肝星状细胞的激活导致各种肝损伤，同时分泌Hyp 、HA 、TIMP 1、TGF β1、α SMA 和PDGF BB ，继续激活肝星状细胞[9]，
因此，抑制肝星状细胞的活化和增殖，诱导活化的肝星状细胞凋亡被认为是可能的抗纤维化策略。
TGF β1通过促进HSCs 向肌成纤维细胞转化，刺激ECM 的合成并抑制其降解，从而导致HSC 永久活化，而HSC 细胞活化后可转化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞表达高水平的TGF β1，进一步诱导静止的HSCs 向肌成纤维细胞转分化并增殖。因此，TGF β1是导致肝纤维化最强的细胞因子，通过抑制TGF β1的产生或阻断其生物活性来抑制HSC 的激活，被认为是抗纤维化的重要靶点[10]。5　结论
本研究以大鼠肝星状细胞为体外细胞模型，从细胞增殖、细胞外基质的合成和沉积以及相关蛋白的表达方面探讨葫芦茶苷抗肝纤维化作用机制，研究证实葫芦茶苷体外具有抗肝纤维化作用，其机制可能与抑制HSC T6细胞的增殖，下调TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白的表达，从而减少肝细胞外基质Hyp 、HA 、TIMP 1的合成和沉积有关。参考文献
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收稿日期：
2021-01-15α-SMA TGF-β1β-actin PDGF-BB （46KD ）
（32KD ）（43KD ）（25KD ）Ⅰ
ⅢⅡⅣⅤ

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