持续及周期流体静压力对大鼠BMSCs增殖及凋亡的影响
目的：通过观察持续及周期静压力刺激对骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖和凋亡的影响，以期为软骨组织工程研究中力学加载方式的选择提供实验依据。方法：全骨髓贴壁分离法分离大鼠BMSCs，经表面标志物检测后，分为对照组（control）、持续流体静压力45Kpa组（45Kpa）、周期流体静压力45Kpa组（0～45Kpa）、持续流体静压力90Kpa组（90Kpa）及周期流体静压力90Kpa组（0～90Kpa），压力加载时间1h，连续加压2天，周期流体静压力的频率为0.1Hz。流式细胞术检测细胞周期和凋亡，激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架。结果：90Kpa及0～90Kpa流体静压力作用下细胞增殖指数显著高于对照组（P＜0.05）；BMSCs加载45Kpa、0～45Kpa、90Kpa及0～90Kpa流体静压力后，细胞骨架光密度值显著高于对照组（P＜0.05）；90Kpa及0～90Kpa流体静压力可导致细胞凋亡（P＜0.05），其中90Kpa持续流体静压力中细胞凋亡率与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。结论：高强度周期流体静压力可促进细胞增殖，而高强度持续压力则导致细胞凋亡，低强度周期压力可促使细胞骨架重组。
标签：流体静压力；骨髓间充质干细胞；增殖；细胞骨架；凋亡
颞颌关节（temporomandibular joint，TMJ）主要承受咀嚼力，是人体的一对联动关节，其关节腔结构复杂，因此髁突软骨在关节腔中承受着多种类型的力学刺激[1]。炎症、感染、创伤、肿瘤等因素可导致髁突软骨损伤或缺损，但因其本身无血管、淋巴的供应及神经支配，所以自身修复能力较差。近年来，随着软骨组织工程技术的不断发展，为临床上软骨损伤提供了新的研究思路。
研究发现，力学刺激是软骨发生、发育及改建的重要因素，因此其在软骨再生修复中的作用受到关注[2-6]。软骨组织工程中，成体干细胞移植物用于关节软骨缺损修复时，同样要担负起承力结构的作用。因此，种子细胞同样处于力学载荷的环境中，其受力后细胞特性的变化受到广泛关注。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem cells，BMSCs）是一种具有多向分化潜能的干细胞，是目前软骨组织工程中较为理想的种子细胞。研究表明，流体静压力可促进BMSCs增殖、细胞骨架改建及软骨向分化[7]。且近年来研究中采用的流体静压力加载方式主要为2种：持续流体静压力及周期流体静压力。这两种力学加载方式对BMSCs细胞特性的影响是否有差异，目前研究较少。因此，本实验采用本课题组自制的压力加载装置对BMSCs加载持续及周期流体静压力，观察这两种力学加载方式对BMSCs增殖、骨架及凋亡的影响，以期为颞颌关节软骨的损伤的软骨组织工程修复提
供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料：SD大鼠（购自第四军医大学实验动物中心）；FITC-鬼笔环肽（Sigma公司，美国）；流式细胞仪（BD公司，美国）；激光共聚焦显微镜（Leica公司，德国）；压力加载装置（本课题组自制，专利号：201310254749）。
1.2方法
1.2.1BMSCs的分离、培养及鉴定。
1.2.1.1BMSCs的分离及培养：脱颈椎处死3～4周龄SD大鼠，无菌条件下分离股骨并去除肌肉及结缔组织。去除骨骺端，用含有胎牛血清的α-MEM培养基冲洗出骨髓，采用200目筛网过滤，1000r/min离心5min，收集细胞。将细胞重悬于培养基（α-MEM、10%胎牛血清）中，于37℃，含5%CO2培养箱中培养。培养后48 h首次换液（半量或全量换液）以去除未贴壁细胞，此后每隔48～72h全量换液，并用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。待细胞覆盖培养瓶壁至70%～80%时，胰蛋白酶消化并进行传代培养。
1.2.1.2 BMSCs表面标志物鉴定：取生长状态良好P3代细胞，胰蛋白酶消化后离心，制成密度为1×105/mL的单细胞悬液。分别加入FITC标记的CD90、PE标记的CD11b、CD34、CD44、CD45、CD29单克隆抗体充分混匀，37proliferation℃孵育2h后，流式细胞仪检测各表面标记物的阳性表达率。
1.2.2力学加载：采用自行设计制作的压力加载装置。实验设置空白对照组（control group）、持续流体静压力45Kpa组（45Kpa）、周期流体静压力45Kpa组（0～45Kpa）、持续流体静压力90Kpa组（90Kpa）、周期流体静压力90Kpa组（0～90Kpa），加载时间均为1h，连续加压2天，周期流体静压力的频率设置为0.1Hz，对照组细胞不加压力，但每天均放置在压力加载装置内1h。
1.2.3流式细胞术检测细胞周期：取生长状态良好的P3代BMSCs，采用细胞饥饿法对细胞进行同步化处理。将培养液更换为不含胎牛血清的α-MEM培养液继续培养细胞24h后弃去，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液继续培养，并按照实验分组对BMSCs加载压力。细胞处理后，胰酶消化并收集，调整细胞密度为1×105/mL。预冷PBS清洗后，70%预冷乙醇重悬细胞，4℃固定24h。细胞于测定前30min加入PI染液，振荡混匀，避光，流式细胞仪（FCM）检测细胞周期。
1.2.4激光共聚焦显微镜检测细胞骨架：取生长状态良好的P3代BMSCs，调整细胞密度为1×103/mL接种于含有无菌盖玻片的24孔板中，制作细胞爬片。按照实验分组对细胞加载压力，爬片采用4%多聚甲醛固定，PBS清洗后采用1%牛血清白蛋白封闭 30 min，5μg/mLFITC-鬼笔环肽室温避光染，甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡：取生长状态良好的P3代BMSCs，采用细胞饥饿法对细胞进行同步化处理。按照实验设计对细胞进行压力加载处理。胰酶消化后调整细胞密度为1×105/mL。测定前加入Annexin V-FITC，室温避光孵育10min，随后加入Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入PI染液，振荡混匀，避光孵育30min，流式细胞仪检测细胞凋亡。1.3统计学分析：所有数据采用SPSS16.0统计学软件对数据（x±s）进行双因素方差分析法；两两比较用SNK-q检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1大鼠BMSCs体外培养：原代培养大鼠BMSCs，光镜下可见BMSCs呈长梭形（如图1a）；当细胞融合达90%以上时可进行传代，传代培养后的细胞形态均一，为长梭形，排列密集，呈漩涡状（如图1b）。
2.2细胞表型鉴定：流式细胞术检测结果显示，第3代BMSCs中96.44%表达CD90，99.95%表达CD44，99.88%表达CD29，4.11%表达CD34，2.56%表达CD45，4.03%表达CD11b（如图2）。结果说明，本实验分离细胞为骨髓间充质干细胞。
2.3持续及周期流体静压力对BMSCs增殖的影响 细胞增殖指数（proliferation index）计算公式为：PI=（S+G2/M）/（G0/1+S+G2/M）×100%。结果显示，细胞加载90KPa持续及周期流体静压力后，其细胞增殖指数显著高于对照组（P＜0.05），而细胞加载45KPa持续及周期流体静压力，其增殖指数对照组相比无显著差异。此外，细胞加载持续流体压力后BMSCs增殖指数与BMSCs加载周期压力后的增殖指数无显著差异（如图3）。结果提示，细胞加载90KPa持续及周期流体静压力均可促进其增殖。
2.4持续及周期流体静压力对BMSCs细胞骨架的影响：激光共聚焦显微镜下观察BMSCs细胞骨架形态，对照组BMSCs的F-actin荧光染呈绿丝状，贯穿整个细胞且沿细胞长轴排列。而经过45KPa、90KPa持续及周期流体静压力作用后其F-actin纤维束排列紧密并且变粗（如图4）。
结果显示，BMSCs加载45KPa持续及周期流体静压力后，其光密度值高于对照组，且差异
极显著（P＜0.01）。且BMSCs经45KPa周期流体静压力作用后，其光密度值显著高于其加载持续流体静压力后的光密度值（P＜0.05）。BMSCs加载90KPa持续及周期流体静压力后，光密度值显著高于对照组（P＜0.05），且两种方式作用后光密度值无显著差异（图5）。结果提示，45KPa及90KPa流体静压力均可促进BMSCs细胞骨架发生改建，且45KPa周期流体静压力的作用最强。
2.5持续及周期流体静压力对BMSCs凋亡的影响：BMSCs加载90KPa流体静压力后，其凋亡率显著高于对照组（P＜0.05），且细胞加载90KPa持续流体静压力后细胞凋亡比例最高，与对照组差异极显著（P＜0.01），与加载90KPa周期流体静压力相比差异极显著（P＜0.01）。BMSCs经45KPa持续及周期流体静压力作用后细胞凋亡率与对照组相比无显著差异（如图6）。
3 讨论
BMSCs作为成体干细胞，其特征为增殖较慢、增殖活性较低[8]。研究显示，机械刺激可促进BMSCs增殖[9-10]。但是，在以往的研究中，关于力学加载方式和力学刺激大小的问题上，学者们的观点并不一致。有学者认为机械刺激可促进BMSCs的增殖。李正章等[11]在
作用于兔BMSCs周期性压力时发现，较小的压力值会使细胞周期发生改变，促进细胞的增殖。而一些研究表明过大的压力会抑制细胞的增殖[12]； 本实验结果显示，细胞加载90KPa持续及周期流体静压力均可促进其增殖，结果提示，高水平的流体静压力，尤其是周期流体静压力能够促进BMSCs的增殖。
细胞骨架（cytoskeleton）是细胞中纤维组成的网架结构，它构成细胞的支撑结构，为维持细胞形态、细胞内物质运输，细胞黏着以及运动等提供支持[13]。当细胞受到力学刺激后，细胞骨架发生重排并发挥物理传导作用，从而传递细胞的力学信号。F-actin是微丝聚合时的主要形式，主要维持细胞的形态和细胞间的连接，本研究通过对F-actin的荧光染，观察不同压力下BMSCs的反应。本实验结果显示，细胞加载45KPa及90KPa流体静压力后均促使BMSCs细胞骨架发生改建，微丝排列紧密且变粗，骨架表达增强，且45KPa周期流体静压力的作用最强。
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，即细胞通过多种信号调控自身发生死亡的过程[14-15]。细胞凋亡最早表现为染体和细胞质固缩，细胞核碎裂，胞膜丧失非对称性，细胞中有凋亡小体的产生，凋亡细胞碎片被周围细胞吞噬消失[16]。有研究发现[17]，细胞凋亡与力学刺
激的大小有关，细胞凋亡随着力值增大增加，当超出细胞的生理承受范围后，细胞的凋亡就会更加明显。在本实验中，用流式细胞术观察压力刺激BMSCs后的细胞凋亡比例，结果显示细胞加载90KPa持续流体静压力后细胞凋亡比例最高，且与加载90KPa周期流体静压力后相比细胞凋亡比例显著增高。分析可能由于高强度的持续静水压超过了BMSCs的生理载荷，因此细胞发生了凋亡。
本实验通过对BMSCs 加载持续及周期的流体静压力，观察两种类型的流体静压力对细胞增殖、骨架改建及细胞凋亡的影响。结果提示，两种类型高强度的流体静压力可促进细胞增殖，但低强度尤其是周期流体静压力可促进细胞骨架改建。同时研究发现，高强度尤其是持续流体静压力可导致部分细胞发生凋亡。以上结果为软骨组织工程研究中力学加载方式的选择提供了实验依据。
[参考文献]
[1]谷志远，傅开元，张震康.颞下颌关节紊乱病[M].北京：人民卫生出版社，2008：13，28，49.

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