姬松茸-灰树花-蛹虫草复合多糖对免疫低下小鼠免疫调节的影响
马传贵1，张志秀1，李红芳2*
1.北京京诚生物科技有限公司，北京 102600；
2.云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500
【摘要】目的：以姬松茸-灰树花-蛹虫草制成的复合多糖，以免疫抑制小鼠细胞免疫功能为主要指标，探究比较复合多糖与各单一多糖对免疫低下小鼠免疫调节功能影响的差别。方法：通过检测小鼠细胞免疫功能和体液免疫功能，并对相关指标进行检验。结果：复合多糖组小鼠的体质量高于同性别的其他单一多糖组；各多糖组小鼠胸腺系数均有不同程度的升高，其中复方多糖组效果最好；复合多糖组IgG、IgA、IgM、sIgA水平升高效果，较单一多糖组血清好；在血液、脾脏T细胞各亚及比值方面，复合多糖升高较好，血液CD4-CD8+降低效果亦优于单一多糖组；复合多糖组T淋巴细胞增殖率高于单一多糖组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：复合多糖对小鼠细胞免疫、体液免疫和T淋巴细胞功能有较好的改善作用，能显著改善免疫抑制小鼠的免疫功能。
【关键词】姬松茸；灰树花；蛹虫草；复合多糖；小鼠；免疫功能
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249(2021)03-0005-04 Effects of compound polysa
ccharides from Agaricus blazei murrill- Griflola frondosa-Cordyceps militaris on the immunological function in immunosuppressive mice MA Chuan-gui1, ZHANG Zhi-xiu1, LI Hong-fang2* (1. Beijing Jingcheng Biotechnology Company Limited, Beijing 102600, Chnia; 2. Yunnan University of
Chinese Medicine，Kunming Yunnan 650500, Chnia)
[Abstract]Objective: To compare the effect of compound polysaccharide and single polysaccharide on the immunoregulation of immunocompromised mice. Methods: the cellular immune function and humoral immune function of mice were tested. Results: the body weight of mice in compound polysaccharide group was higher than that of other single polysaccharide groups of the same sex; the thymus coefficient of mice in each polysaccharide group increased to different degrees, and the effect of compound polysaccharide group was the best; the effect of compound polysaccharide group was better than that of single polysaccharide group in serum IgG, IgA, IgM, SIgA; the effect of compound polysaccharide was better than that of single polysaccharide in blood CD4 / CD8, spleen CD4 / CD8, and blood CD4-CD8 +The results showed that the effect of decreasing was good, the effect of increasing T-lymphocyte proliferation rate of compound polysaccharide group was better than that of single polysaccharide group, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion: the compound polysaccharide has a better effect on improving the cellular immunity, hu
moral immunity and T lymphocyte function of mice, and can significantly improve the immune function of immunosuppressed mice.
[Key words]Agaricus blazei murrill; Griflola frondosa; Cordyceps militaris; Compound polysaccharides; mice; immunological function
多糖广泛存在于动植物以及真菌体内，组成和结构上的差异亦使其生物学活性复杂多样，植物多糖分子存在2-10个单糖聚合而成的寡糖片段，通过与蛋白受体结合，激活巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)等免疫细胞表面存在的多糖受体，产生类似酶作用过程的效果，进而影响淋巴细胞基因表达，促使T、B淋巴细胞的增殖，调节细胞因子分泌、活化补体，促进抗体产生等[1][2][3]。姬松茸多糖有广泛的药理活性，在抗肿瘤、增强免疫力、抗疱疹病毒、影响造血功能等方面优势突出[4]；灰树花多糖具有肿瘤增殖抑制、免疫调节作用，较好的降糖和抑菌、抗病毒作用[5]；蛹虫草多糖具有保肝抗肝炎、抗氧化、抗癌等生物活性，是一种非特异性免疫增强剂[6]。研究表明，单一活性多糖按优化的组合比例组合，其生物活性更强。本研究的复合多糖由姬松茸多糖、灰树花多糖、蛹虫草多糖根据多糖含量按1:1:1比例组成，以免疫抑制小鼠细胞免疫功能为主要指标探究比较姬松茸-灰树花-蛹虫草的复合多糖与各单一多糖对免疫低下小鼠免疫调节功能影响的差别，从而为复合多糖在增强免疫功能方面是否有相互协同作用提供思路。
1 材料与方法
1.1材料与仪器 食用菌复合多糖(姬松茸-灰树花-蛹虫草)、姬松茸多糖、灰树花多糖、蛹虫草多糖均由我机构提供；4通道AccuriC6流式细胞仪、流式抗体CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PerCP荧光抗体及同型对照抗体、校准微球、红细胞裂解液均购于美国BD公司；小鼠免疫球蛋白检测IgG、IgA、IgM试剂盒购于美国ICLLAB公司；刀豆蛋白(ConA)购自美国Sigma公司；CCK8由我机构提供，环磷酰胺标准品(批号：C3250000)，为山西普德药业有限公司产品；Sysmex XT-2000iv血液分析仪专用试剂购自日本Sysmex公司。
1.2供试动物 健康雌雄小鼠120只，8～10周龄，雌雄各半，体重为(20±2)g，由我机构实验动物中心提供。动物合格证号为：SCXK(京)2018-0010。昼夜交替饲养，饲养环境温度20℃～22℃。
1.3试验方法 ①动物分组及处理[7]：将实验小鼠随机正常对照组、模型对照组、复合多糖组及姬松茸多糖、灰树花多糖、蛹虫草多糖3个单一多糖组，每组20只小鼠，雌雄各10只。正常对照组和模型对照组，灌胃蒸馏水，体积为10mL/kg；各多糖组分别相应等体积多糖成品灌胃，连续31d；除正常对照组外，其他各组在灌胃后第24d开始注射环磷酰胺(CTX)(40mg/kg/d，ip)，连续3d。次注射后第5d，脱颈椎处死，取胸腺和脾脏精密称取。②血液学检测：给药第31d解剖小鼠，摘眼球采血，用XT-2000iv血液分析仪测定血RT、WBC总数及分类计数、Rtc 比例等。③脾细胞制备：无菌取出脾脏，剪碎，过筛，轻轻吹开脾脏细胞，在4℃下1100r/min离心10min，弃上清液，再悬浮细胞，加入红细胞裂解液，搅拌均匀，裂解约5min，加入5mL PBS，终止裂解，在转速1100r/min，4℃环境下，离心10min，
弃上清液，清洗，在RPMI-1640中培养，重悬浮细胞，稀释，计数脾细胞。④血液淋巴细胞CD3/CD4/CD8、脾淋巴细胞分：在50μL小鼠静脉全血中，加入按比例CD3/CD4/CD8混合抗体8μL；同
样体积加入制备好的脾细胞(5×106/mL)50μL，以及CD3/ CD4/CD8/CD69按比例混合抗体13μL。上述两组管内环境均室温下避光，孵育30min；裂解红细胞，清洗2次；加细胞固定液100μL/管进行流式分析。⑤血清IgA、IgG、IgM含量测定，按试剂盒要求用夹心ELISA法检测。⑥肠黏液采集与处理检测sIgA：取回盲部小肠，纵切，轻轻刮肠腔，除去粪便，载玻片轻刮去肠黏膜表面黏液，放入埃彭多夫微量离心管中，用0.9%氯化钠注射液3mL反复冲洗整个小肠腔，用5mL无菌离心管收集冲洗液，充分震荡混匀，在4℃、1500r/min环境下，离心5min，收集上清液，测定sIgA。⑦脾淋巴细胞增殖检测：使用96型号板孔，并设3个复孔，加入90μL脾细胞(5×106/mL)和10μL刀豆蛋白ConA(50μg/mL)孵育40h，分别加入CCK8试剂，采用450纳米波长检测，计算增殖率。
脏器系数=脏器重量(mg)
动物重量(g)
×10
1.4实验数据统计 采用SPSS2
2.0统计软件进行处理，计量资料描述以均数±标准差表示，多个样本均数比较，经方差齐性和正态分布检验后采用单因素方差分析，采用t检验进行组间比较；计数资料描述以率、百分比等一般性描述，采用卡方检验或Fisher精确概率法进行比较，以P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1复合多糖对CTX致免疫低下小鼠体质量的影响 实验数据显示，给药第31d，对照组及各多糖组同性别小鼠，各组组间小鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)，但同性别比较，姬松茸-灰树花-蛹虫草的复合多糖组小鼠的体质量明显高于高于其他单一多糖组(姬松茸多糖组、灰树花多糖组、蛹虫草多糖组)(P<0.05)，详见表1。
2.2复合多糖对CTX致免疫低下小鼠胸腺系数的影响 结果如图1所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠胸腺系数显著降低(P<0.05或P<0.01)。其他多糖组别小鼠胸腺系数较免疫低下小鼠的模型对照组均有一定程度的升高，升高幅度以复合多糖组最高(P
<0.05)。
图1 复合多糖对CTX致免疫低下小鼠胸腺系数的影响
(
_
x±s，n=10)
A.正常对照组；
B.模型对照组；
C.复合多糖组；
D.姬松茸多糖组；
E.灰树花多糖组；
F.蛹虫草多糖组
注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05
2.3复合多糖对CTX致免疫低下小鼠体液免疫的影响结果 如表2所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清IgG、IgA、IgM、sIgA水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与免疫低下小鼠的模型对照组比较，其他多糖组别小鼠血清IgG、IgA、IgM、sIgA水平都呈现出不同程度的增加，增加幅度以复合多糖组最高(P<0.05)。
表1 给药31d后各组同性别小鼠体质量比较(_
x±s)
组别(n=20)
体质量(31d)
P值雄性雌性
正常对照组29.9±2.229.5±2.5>0.05
模型对照组27.3±2.726.9±3.4>0.05
复合多糖组36.9±4.337.3±3.8>0.05姬松茸多糖组32.5±3.2*31.7±3.7**>0.05灰树花多糖组32.8±2.9*33.2±2.4**>0.05蛹虫草多糖组31.2±3.1*30.9±3.4**>0.05注：与复合多糖组比较，各单一多糖组雄性小鼠体质量*P<0.05；各单一多糖组雌性小鼠体质量**P<0.05；
表2 复合多糖对CTX致免疫低下小鼠体液免疫的影响(μg/mL，_
x±s，n=20)组别IgG IgA IgM sIgA 正常对照组487.62±68.73 3.86±0.23298.73±58.49 3.47±0.66模型对照组220.16±51.34** 2.13±0.51*205.57±31.58* 2.34±0.45*复合多糖组475.76±61.77## 3.97±0.17
##322.69±71.72# 3.11±0.38#姬松茸多糖组271.18±41.51# 3.03±0.47 #270.82±58.69# 2.56±0.89灰树花多糖组278.26±59.35 3.19±0.94 #280.75±70.35# 2.49±0.54蛹虫草多糖组316.94±34.97 2.76±0.52263.84±28.29 1.98±0.61注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01; 与模型对照组比较，#P<0.05
2.4复合多糖对CTX致免疫低下小鼠T淋巴细胞分化成熟的影响结果 如图2～图4所示，与正常对照组比较，模型对照组在血液CD4/CD8、脾脏CD4/CD8均显著升高，血液CD4-CD8+均显著降低(P<0.05或P<0.01)。其他多糖组小鼠较单纯免疫低下小鼠的模型对照组，其血液CD4-CD8+均呈现一定程度的升高，血液及脾脏CD4/CD8均出现不同程度降低，效果以复合多糖组最优(P<0.05)。
图2 复合多糖对CTX 致免疫低下小鼠血液CD4/CD8的影响
(_
x ±s ，n =10)A.正常对照组；B.模型对照组；C.复合多糖组；D.姬松茸多糖组；E.灰树花多糖组；F.蛹虫草多糖组
注：与正常对照组比较，*P <0.05，**P <0.01; 与模型对照组比较，#P
<0.05
图3 复合多糖对CTX 致免疫低下小鼠脾脏CD4/CD8的影响
(_
x ±s ，n =10)A.正常对照组；B.模型对照组；C.复合多糖组；D.姬松茸多糖组；E.灰树花多糖组；F.蛹虫草多糖组
注：与正常对照组比较，*P <0.05，**P <0.01; 与模型对照组比较，#P
<0.05
图4 复合多糖对CTX 致免疫低下小鼠血液CD4-CD8+的影
响(_
x ±s ，n =10)A.正常对照组；B.模型对照组；C.复合多糖组；D.姬松茸多糖组；E.灰树花多糖组；F.蛹虫草多糖组
注：与正常对照组比较，*P <0.05，**P <0.01; 与模型对照组比较，#P <0.05
2.5复合多糖对CTX 致免疫低下小鼠T 淋巴细胞增殖能力的影响结果 如图5所示，与正常对照组比较，模型
对照组小鼠T 淋巴细胞增殖率显著降低(P <0.05)。其他多糖组与模型对照组比较，复合多糖组的T 淋巴细胞增殖率
升高效果高于单一多糖组。
图5 复合多糖对CTX 致免疫低下小鼠T 淋巴细胞增殖能力
的影响(_
x ±s ，n =10)A.正常对照组；B.模型对照组；C.复合多糖组；D.姬松茸多糖组；E.灰树花多糖组；F.蛹虫草多糖组
注：与正常对照组比较，*P <0.05，**P <0.01; 与模型对照组比较，#P <0.05
3 讨论
现代社会生活节奏快，工作压力大，人体免疫系统疾病发病率随之上升，目前调节机体免疫力药物主要以化学合成药物为主，但其副作用明显，疗效持续较短、药物残留体内、用药时间成本过长等。而中草药成为近年研究热点，因其具有药效持续时间长、无机体药物残留、对机体影响小等优点。目前已开发有一百种以上的中药多糖类化合物均发现具有免疫促进作用。姬松茸多糖、灰树花多糖、蛹虫草多糖等真菌类多糖大多具有抗氧化、抗癌、增强机体免疫功能等生物活性，是一种非特异性免疫增强剂。本研究通过CTX 导致的免疫低下模型造模方法，使实验小鼠体质量增长减缓，胸腺系数降低，血清免疫球蛋白水平降低，探讨给予小鼠以上按一定比例组成的复合多糖，是否对免疫低下小鼠的免
疫力具有增强的作用。
免疫球蛋白分泌的量，反映了体液免疫的功能[8]。CD4和CD8是T 淋巴细胞重要的表面抗原，辅助性T 细胞(Th)属于CD4+T 细胞亚，细胞毒性T 细胞和抑制性T 细胞(Ts)属于CD8+T 细胞。各亚数量和功能产生异常时，细胞免疫应答及迟发型超敏反应、细胞毒作用均受到抑制，机体免疫系统紊乱并发生病理变化。ConA 是促细胞有丝分裂素，可使大量T 细胞克隆活化[9]，当T 淋巴细胞功能增强时，ConA 能激发其更快增殖，从而提高小鼠细胞免疫水平。
综上所述，本研究等剂量姬松茸多糖-灰树花多糖-蛹虫草多糖的复合多糖，对于提高小鼠细胞免疫、体液免疫，以及增强T 淋巴细胞功能均有更好的作用，可显著改善免疫抑制小鼠免疫功能，说明这三种多糖的复合多糖在增强免疫功能方面有相互协同作用，值得临床推广，研究其更好地混合比例，以期取得更精确的增强免疫功能效果。
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记的记录保证了患者康复锻炼的频率和效率、责任护士监测管理促进患者进行主动康复锻炼等几方面提高了患者康复锻炼的依从性，从而有效促进患者膝关节的康复。
3.2“5E”康复模式可以有效促进交叉韧带重建术患者的膝关节康复 表4结果显示干预1个月、3个月观
察组Lyshlom膝关节评分高于对照组(P<0.05)，表5结果显示干预1个月、3个月观察组关节活动度高于对照组(P<0.05)，这说明“5E”康复模式可以有效促进前交叉韧带重建术后康复效果。研究显示94%的患者期望ACLR重建术后1年内恢复到损伤前的运动水平[15]，而只有56%～58%的患者恢复到受伤前的水平，仅有44%的人恢复到竞技体育水平[16]，主要原因是以往护理人员忽视了康复锻炼的重要性，没有积极的引导、鼓励患者加强康复锻炼；也没有进行系统的、个体化的知识教育，缺乏对康复训练的认知[17]；更未进行锻炼动作、时间、频率的监测，未能达到锻炼的效果，不能有效的促进膝关节功能的恢复。本研究引入“5E”康复模式，通过医护人员积极与患者沟通，了解患者的心理需求，积极引导患者解除锻炼过程中的疑虑；根据患者病情、年龄、文化程度分阶段、个体化疾病知识教育；一对一膝关节功能锻炼指导和记录康复日记监测锻炼；加强拐杖和支具的练习，争取独立完成日常活动和工作；责任护士及时评估锻炼效果，根据锻炼效果调整锻炼计划5个环节，实现对患者全方位的护理干预，能够全面促进前交叉韧带重建术患者膝关节功能康复。
综上所述“5E”康复模式可以提高前交叉韧带重建术患者锻炼依从性，改善前交叉韧带重建术患者的膝关节功能，值得临床进一步推广应用。
参考文献
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作者简介：刘凯燕，护师，硕士研究生在读，宁夏医科大学护理学院；*通信作者：刘淑敏，宁夏医科大学护理学院。
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作者简介：马传贵(1985-)，男，高级菌类园艺工，中药师，主要从事食药用菌的科学研究、开发应用和科普教育工作。E-mail：********************
*通信作者：李红芳(1974-)，女，讲师，理学博士，主要从事天然药物化学分析。E-mail：*****************
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