Image-Pro Plus计数阳性细胞进阶教程
  摘要】计数阳性细胞是 Image-Pro lusP的常见应用。然而由于原始照片质量不佳或拍摄视野不能覆盖观察区域等问题，用 Image-Pro Plus计数阳性细胞可能得不到理想的结果甚至失败。通过提高原始照片质量、拼图及不同计数方法的应用能有效应对这些问题。
【关键词】Image-Pro Plus 阳性细胞 计数
【中图分类号】R312 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）08-0129-02
        Image-Pro Plus是由美国Media Cybernetics公司所推出图像分析软件，常用于病理显微图像分析、面积形态和光密度分析、免疫组化、荧光图像分析等方面[1,2]。计数阳性细胞也是Image-Pro Plus的常见应用，但有时受限于照片的拍摄而得不到理想的结果甚至失败。本文从个人实践出发，讲解一下应对的经验方法。 
        1 提高原始照片的质量
        1.1所有照片必须在完全同样的显微镜条件下拍摄。在更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。相比在使用高倍镜时对焦及寻视野的麻烦，保持各张切片的拍摄条件一致更重要。
        1.2数码相机必须全部用手动设置。保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈，同样的变焦（固定焦距）。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉。手动曝光多试几次，直到满意为止，然后就固定不要变了。
        1.3组织切片染不宜太深。拍摄出的照片颜较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的温正确。既不偏黄，也不偏蓝。最好给显微镜光源配稳压电源。显微镜的亮度要前后保持一致：光源亮度调节在拍摄一组照片的过程中不能动。聚光镜也不能调。
        1.4显微镜和相机一定要稳定，相机设为自拍模式可以消除按快门时的手震。 
        2 视野不够时使用拼图法
        2.1先拼图。首先要在显微镜下照一组(n × n张)照片，各张照片视野之间得有一定的重合。为了不使排列混乱，最好的行列数据命名照片。Process/title image，先点all把图片都选上，再点showlayout，这时就出现了一张拼接的新图片。当然，现在它们的边界并没有准确地拼合到位。点adjust，弹出调试位置窗口，把图片一张张地细调位置，具体方法是：先在某一张图片上点一下，就可以用箭头键移动其位置 (同时按shift可以快调 )，也可以用鼠标
点窗口里的箭头。关键是要准图片的相同部位，在两图片的重叠区是两图片相减的图像，如果重叠得准确，会呈现平整画面，如有微小不合，就呈现浮雕样的画面。依次把所有图片调整好位置后，点一下apply就生成一张新的大图片了。
        2.2后校正。拼接完毕后，如果发现有拼接痕迹，使用如下的方法较正：1）发现有其中的一两幅图片背景与其他的不一致，解决方法：把这些图像使用Sequence/Merge Images的方法变成序列图，然后使用 Normalize illumination把背景均衡化。2）发现拼接后的图像都是拼接区域强度偏弱，其他区域强度偏强（更亮），解决方法：移开样本，拍摄一张完全空白的背景图像，然后Sequence/Background correction，做图像背景均衡化。然后再做拼接就行了。 
        3 数细胞
        3.1手工标点计数法。Measure/measurements，点 measurements面板features工具第一列第二个create point feature，在图片窗口点选即可。点软件主菜单下快捷工具按纽第二行那个像照相机的按纽（snappicture of image with measurement overlays）可以将标记了的图片以快照方式另存。
        3.2逐一定义AOI（area of interest）法。点快捷工具按纽第一行13个（irregular AOI），
弹出Magic ward或Trace，两者可互相切换。 Magic ward下，鼠标在图片窗口变成魔术棒，点击可大致沿细胞边缘选中。再点快捷工具按纽第一行14个（Multiple AOI），选Add，再用魔术棒点下一个细胞，再 Add，依次重复。Measure/count/size，弹出的 count/size面板，菜单栏点edit/convert AOIs to Objects，即在 count/size面板上total count显示计数，图片同时显示计数标记。这种方法的好处是选中的细胞可以用来测量，测量结果可以输出到excel作统计。
        3.3定义class，自动计数法。Measure/count/size，弹出 count/ size面板，Intensity range selection区域内有三个选择：automaticbright objects和 automaticdark objects分别定义灰度在128-255和0-128的对象，选中后点count即自动计数。这多用于荧光照片。点delete恢复到计数前。更常用的是第一种选择：Manual，点 select colors，弹出segmentation面板，选colorcube based页，用吸管工具选取细胞彩，相近彩的细胞即自动被选中。点close，再点count完成计数。segmentation面板如果选histogram base页，将右边下拉选框中的 RGB改为HSI（H为调，就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S为饱和度，I为强度），点一下H，直方图显示就是图片各象素 H值的分布，在直方图的两边各有一根线，这就是选择线，同理S,I，首先保持 S、I为最大范围，从H中选择感兴趣的细胞颜，一
般免疫组化多为棕黄，微调选择线使选中区域满意。点close，再点count完成计数。
        这种方法的优点是自动，缺点是可能把一些错误引入。提高正确率首先切片质量要好，照片拍的要好；其次是定义 AOI尽可能仔细准确；再次可以通过软件提供的校正方法：1）filter，利用一些参数特点将不合要求的滤除。在count/size面板上将apply filter ranges选项勾上。Measure/select measurements，弹出select measurements面板，左边是可供测量的参数（最常用的是area、density(mean)、IOD），选中即出现在右边，在右边选中后激活下面的范围选择，选择适当范围即可将不在范围内的滤除（如area，start选50，则将所有小于 50像素的杂点均去除）。回到 count/size面板，再点count，即重新计数，显示 filter后的结果。2）split，用于将两个合并在一起的点分开。有时两个细胞距离太近，软件会把他们认成一个。count/size面板，edit/split objects，左键在图片上拖出一条线分割细胞，右键确定，计数结果将自动改变。3）merge，用于将多个点合并成一点。count/size面板，edit/draw/mergeobjects，左键框中几个细胞，右键确定，计数结果将自动改变。
参考文献image pro plus
[1] Jairo Silva Francisco, Heleno Pinto de Moraes, Eliane Pedra Dias. Brazilian Oral Research, 2004, 18(2).
[2] 许扬. 中国比较医学杂志，2007年，17卷 (12)期 .

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