文章编号：1003-6946(2021)02-0121-06
STAT3基因介导表观遗传学调控对子痫前期发病
的影响机制
张晓丽，赵晓勇
(南方医科大学附属花都医院妇产科，广东广州510800)
【摘要)目的：探讨滋养细胞STAT3基因介导表观遗传学调控对子痫前期(PE)发病中的影响机制。
方法：收集30例正常(Con组)和30例子痫前期(PE组)产妇胎盘组织，采用Real time-PCR和Western
blot检测DNMT1、STAT3、PTEN、TSC2mRNA和蛋白表达水平，甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-Seq)检测甲基化程度差异。体外培养HTR8/Svneo、JEG-3、JAR、BeWo滋养细胞株，分为空白
对照组(Con组)、STAT3沉默组(shSTAT3组)、STAT3过表达组(STAT3,,E组)。应用去甲基药物(5-
AZA-DC)处理，采用GST-pull down，染质免疫共沉淀实验(CHIP)，双荧光素酶报告基因，甲基化特异
性PCR(MSP)和亚硫酸盐测序PCR(BSP)检测。结果:①在胎盘组织中，与Con组相比，PE组胎盘组织
中DNMT1mRNA和蛋白[(5.25±1.12vs&02±0.67)ng/ml、(3.33±0.98vs7.31±0.55)p,g/rnl,P<
0.05]表达升高,STAT3[(5.17±0.98vs2.27±0.33)ng/ml、(6.12±1.03vs2.59±0.43),P<
0.05]、PTEN[(4.58±0.77vs1.97±0.28)ng/ml,(6.21±1.04VS2.28±0.36)“g/ml,P<0.05]、TSC2
[(6.39±0.83vs3.16±0.52)ng/ml、(6.56±0.67vs3.03±0.17)|xg/ml<0.05]mRNA和蛋白表达
下降。MeDIP-Seq检测出PE组甲基化水平显著增高，其中STAT3、PTEN、TSC2基因为甲基化差异显著
基因，差异有统计学意义(P<0.05)o②在细胞株中，与Con组相比，GST-pull down验证HTR8/Svneo
细胞中STAT3与PTEN、TSC2蛋白体外相互作用，CHIP证实在HTR8/Svneo、JEG-3、JAR、BeWo细胞中
STAT3能明显富集靶基因PTEN，双荧光素酶报告基因验证HTR8/Svneo、JEG-3、JAR、BeWo细胞中
STAT3调控PTEN启动子活性,5-AZA-DC干预后显著改善，差异有统计学意义(P<0.05)o MSP和
BSP检测HTR8/Svneo细胞中PTEN基因启动子区CpG岛DNA甲基化,5-AZA-DC干预前shSTAT3、
STAT30E组甲基化显著，干预后呈非甲基化，差异有统计学意义(P<0.05)。结论:STAT3基因是介导
表观遗传学调控引起PE发病的重要基因，可作为子痫前期表观遗传学的潜在靶点。
【关键词】STAT3；表观遗传学调控；子痫前期；影响；机制
中图分类号：R714.24'4文献标志码：A
Effect of Epigenetic Regulation Mediated by STAT3Gene on Preeclampsia and
its Mechanism
ZHANG Xiaoli.ZHAO Xiaoyong
(Department of Obstetrics and Gynecology,Huadu Hospital.South Medical University,Guangzhou Guangdong
510800.China)
Correspondence author：ZHAO Xiaoyong
[Abstract]Objective：To investigate the effect of epigenetic regulationmediated by STAT3gene in trophoblast
cells on preeeclampsia and its mechanisms.Methods：30normal(Con group)and30preeclampsia(PE group)
placental tissues were collected.The mRNA and protein expression levels of DNMT1,STAT3,PTEN and TSC2
were detected by Real time-PCR and Western blot.The differences of methylation levels were detected by Me
DIP-Seq.HTR8/Svneo.JEG-3,JAR and BeWo trophoblast cell lines were cultured in vitro and divided into blank
control group(Con group).STAT3silencing group(shSTAT3group)and STAT3overexpression group(STAT30E
group).Celles were treated with demethylated drugs(5-AZA-DC) and detected using GST-pull down,Chromatin immunoprecipitation assay(CHIP).double luciferase reporter genes.Methylation-specif
ic PCR(MSP)and Sulfite
基金项目：广东省自然科学基金(编号：2016A030313419)；r东省医学科研基金(编号:A2018328)；广东省中医药局科技项目(编号=20191256)通讯作者：赵晓勇.E-mail:i
sequencing(BSP).Results：1In placental tissues of PE group.DNMT1mRNA and protein levels increased [(5.25±1.12vs8.02±0.67)ng/ml,(3.33±0.98vs7.31±0.55)pg/ml,P<0.05compared with those in Con group.The mRNA and proteins levels of STAT3[(5.17±0.98vs2.27±0.33)ng/ml,(6.12±1.03vs2.59±0.43)M g/ml,P<0.05].PTEN[(4.58±0.77vs1.97±0.28)ng/ml,(6.21±1.04vs2.28±0.36)M g/ml, P<0.05and TSC2[(6.39±0.83vs3.16±0.52)ng/ml,(6.56±0.67vs3.03±0.17)pg/ml,P<0.05]decreased in PE group compared with those in Con group.MeDIP-seq detected a significant in c rease in methylati o n levels in the PE group.The methylation levels of STAT3,PTEN and TSC genes were significantly different in two groups(P<0.05).2In the cell linepared with the con group,GCS-pull down verified the in vitro interaction of STAT3with PTEN and TSC2proteins in HTR8/Svneo cells.CHIP demonstrated the direct binding of STAT3to PTEN in HTR8/Svneo,JEG-3.JAG and Bewocells.The double luciferase reporter gene verified that STAT3regulated the promoter activity of PTEN in HTR8/Svneo.JEG-3,JAG and Bewocells,which was significantly improved after5-AZA-DC intervention(P<0.05).MSP and BSP were performed to detect DNA methylation in the CpGis-land of pr
omoter region of the PTEN gene in HTR8/Svneo cells.Before5-aza-dc intervention.the groups of shSTAT3and STAT3OE were significantly methylated.After intervention,the two groups were shown to be non-methylated,and the differenee was statistically significant(P<0.05).Conclusion s：STAT3gene is an impor-tant gene to mediate epigenetic regulation in the process of preeclampsia,which could be served as a potential target for preeclampsia epigenetic therapy.
[Key words]STAT3；Epigenetic regulation；Preeclampsia；Influence；Mechanism
子痫前期（preeclampsia,PE）是造成孕产妇、围产儿发病率和死亡率升高的一种严重妊娠期高血压疾病，具体的病因和发病机制至今仍未完全阐明"。PE在全球产妇中的发病率为3%~5%，并且在发展中国家，PE造成的产妇死亡占产妇总体发病死亡率的25%7表观遗传学调控与转录水平上的基因表达之间的关系是复杂的，对转录有显著影响'3目前对于表观遗传学调控在PE发病屮的作用机制询不清楚4'5］。我们推测PE胎盘滋养细胞STAT3、PTEN和TSC2基因的表达和功能性调控可能与该基因启动子区域CpG岛的甲基化状态有关。深入研究表观遗传学调控分子的功能影响，不仅能阐明它们在PE发生中的作用机制，还能为PE的靶向提供潜在的靶点。本研究通过临床样本和体外HTR8/Svneo、JEG-3JAR s BeWo滋养细胞株相关实验结合分析.深入探讨表观遗传学调控对PE发病的影响及机制。
1材料与方法
1-1研究对象选择2019年1~12月在南方医科大学附属花都医院产科住院分娩的孕妇60例，其中30例正常足月妊娠（Con组），30例PE妊娠（PE组）。所有孕妇平素体健，无心脏病等系统性疾病、传染性疾病和家族性疾病史，无妊娠期高血压疾病、胎盘早剥或前置胎盘等妇产科疾病史，患者均剖宫产。研究方案均获得医院伦理委员会批准（编号:2019130），患者均签订知情同意书及同意捐献组织标本协议书
1.2材料HTR8/SVneo购自上海科学院上海生命科学院细胞资源中心。JEG-3JAR、BeW。滋养细胞株购自美国模式培养物集存库（American type culture collection,ATCC）O HTR8/SVneo和JAR细胞的培养液是RPM11640,JEG-3和BeWo细胞的培养液是DMEM/F12，细胞培养液中均需要加入10%胎牛血清以及双抗（100U/ml青霉素和100|ig/ml链霉素）。所有细胞均放置于37T,5%C0：的孵箱中培养。
1.3主要仪器和试剂精密电子天平（Mettler Toledo公司，瑞士）；电泳装置（Bio-Rad公司，美国）；Mx3000PTM Real-time PCR System系统（Stralagene公司，美国）；Hi Seq2000测序仪（llluinina公司，美国）；凝胶电泳成像系统（Synoptics Ltd.英国）STAT3—抗为兔抗人多克隆抗体（稀释度为1：100）（Abeam公司，美国）;PTEN一抗为兔抗人单克隆抗体（稀释度为1:100）（Abeam公司，美国）；|3-actin兔抗人单克隆抗体（Sigma-Alorich公司，美国）；DNMT1抗体（Abeam，美国）；抗PTEN抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）;TSC2抗体以及辣根过氧化物酶偶联的二抗（抗兔、抗鼠,Santa Cniz公司，美国）。
1.4方法
1.4. 1Real time-PCR检测两组胎盘组织中DNMT1、STAT3、卩rEN、TSC2mRNA表达胎盘组织放1.5ml EP 管内，加入1.0ml的Trizol溶液，于4^,12000r/min，离心10分钟振荡洗涤RNA沉淀1次,7500r/niin离心5分钟将提取的RNA，利用微量RNA/DNA定量仪测定RNA浓度。应用2a，法进行|十算，实验重复3次。
1.4.2Western blot检测胎盘组织中DNMT1、STAT3、PTEN JYC2蛋白差异胎盘组织放入1.5ml EP管中加约100»1/30mg）RIPA蛋白裂解液,4七,12000r/min,15分钟。一抗孵育.4乜摇床上过夜孵育。STAT3、PTEN中加入山羊抗兔二抗，其稀释比例1:1000.DNMT1、TSC2及p-aelin中均加入山羊抗小鼠二抗，稀释比例1:1000
用Image-Pro Plus图像分析.
1.4.3胎盘组织甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-Seq）胎盘组织用1%甲醛处理，使DNA-protein 的相互结合作用被交联固定，基因组DNA超声打断至100~500bp的片段。用Magnetic Methylated DNA Inimu-noprecipitation kit的5-mC抗体对基因组DNA进行沉淀富集。合格的文库用于Illumina-Hi Seq2000测序。
1.4.4细胞分组及去甲基药物5-AZA-DC处理各细胞株分为空白对照组（Con组）、子痫前期STAT3沉默组（shSTAT3组）、子痫前期STAT3过表达组（STAT3,,E 组）。各组细胞于六孔板中加入含5ixmol/L5-AZA-DC （Sigma,St.Louis,MO,USA）的新鲜培养基.并每日更换。72小时后收获细胞:
1.4.5GST-pull down证明STAT3与PTEN、TSC2体外表达蛋白的相互作用取HTR8/Svneo细胞株实验,4^,12000r/min,15分钟。加入His-tag-STAT3、GST-PENT,GST-TSC2及GST蛋白。实验组（output 组）中加入20|±1Glutathione琼脂糖珠，含有GST空蛋白Glutathione琼脂糖珠为对照。output组样品加入Glutathione琼脂糖珠样品.Western blot检测分析。
1-4.6染质免疫共沉淀实验（ChIP）验证转录因子STAT3与靶基因PTEN直接结合作用4*, 12000r/min,15分钟。超声破碎仪处理，取上清10口1作为对照（input），余下上清液分别加入2吨一抗和相应的兔IgG,4T孵育过夜。4七,12000r/min,15分钟。PCR检测，得到的PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离并分析。
1.4.7双荧光素酶报告基因实验含有PTEN启动子序列的基因插入pGL3-Basic/luciferase载体luciferase的上游，为pGL3-PTEN-luc o用Lipofectamine2000转染质粒，双荧光素酶报告系统试剂盒检测luciferase 荧光强度。单管发光荧光检测仪检测样品中的Luciferase和Renilla的表达强度。
1.4.8MSP和BSP检测PTEN基因启动子区CpG岛DNA甲基化取HTR8/Svneo细胞株实验，每20“IDNA 样品中加入130pj CT Conversion Reagant混匀。将混合液放入PCR仪上进行MSP反应。将1~3nil样本和250（J.1Proteinase K移入15ml离心管中,3500r/min,3分钟.将收集到的DNA用亚硫酸氢钠处理：
1.5统计学分析采用Prism8统计学软件分析，正态分布的计量资料用丘士s表示。多组间比较采用单因素
方差分析，组间比较采用/检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组临床资料比较与Con组相比,PE组年龄、体质量指数（BMI）差异无统计学意义（P>（）•05），分娩孕周、收缩压及舒张压、蛋白尿、新生儿体质量、Apgar 评分、胎盘质量差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1PE组与Con组临床资料比较
Tab1Comparison of general clinical data between
PE group and Con group
PE组5=30)Con组5=30)P
年龄（岁）26.25±3.8326.11±3.050.062分娩时BMI(kg/m2)25.89±1.1525.57±1.120.077分娩孕周（w）33.25±1.8135.64±1.030.028收缩压（mmHg）163.27±5.27110.58±5.190.015舒张压（mmHg）104.36±1.4578.39±1.330.033蛋白尿（g/24h）7.32±1.15--
新生儿体质量（g）2150.69±225.313722.27±359.600.016 Apgar评分（1分钟）7.35±1.129.01土0.510.033 Apgar评分（5分钟）8.88±1.0110.03±1.010.026胎盘质量（g）435.67±102.30552.31±114.710.021
2.2Real time-PCR和Western blot检测胎盘组织中的DNMTl、STAT3、PTEN、TSC2mRNA和蛋白表达Con组与PE组胎盘组织中均可检测到DNMTl、STAT3、PTEN、TSC2mRNA和蛋白的表达。与Con组mRNA和蛋白相比,PE组DNMTl表达上调,STAT3、PTEN、TSC2表达下调，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2、表3。
mRNA in placental tissues detected by Realtime-PCR(ng/ml)表2Real time-PCR检测胎盘组织中
DNMTl STAT3PTEN.TSC2mRNA差异（ng/ml）
Tab2The difference of DNMTl,STAT3,PTEN and TSC2
正常妊娠组PE组i P DNMTl 5.25±1.128.02±0.67 2.9870.019 STAT3 5.17±0.98 2.27±0.33 2.8810.023 PTEN 4.58±0.77 1.97±0.28 2.8630.025 TSC2 6.39±0.83 3.16±0.52 3.0150.016表3Western blot检测胎盘组织中DNMTl、
STAT3PTEN、TSC2蛋白差异(pg/ml) Tab3The differences of DNMTl.STST3,PTEN and TSC2 proteins
in placental tissues detected by Western blot(|jLg/ml)
正常妊娠组PE组t P DNMTl 3.33±0.987.31±0.55 2.7740.027 STAT3 6.12±1.03 2.59±0.43 2.7780.026 PTEN 6.21±1.04 2.28±0.36 2.8540.025 TSC2 6.56土0.67 3.03±0.17 2.8820.023 2.3胎盘组织甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-Seq）Con组和PE组胎盘组织STAT3、PTEN和TSC2基因的CpG岛位于启动子区域，故CpG岛的甲基化会使STAT3.PTEN和TSC2基因显著
F ■调，不同部位的差异最显著的基因启动子区域和 C P (；岛区域的聚类热图，见图1。
Con3
Coni
Con2AKT3 sFlTI
S3PIGF
NDRl.l AKTI
ITIMP2(OI'SPI PD-LI STAT 3TSf2Kacl IMP-2PD-I TSC1MMP-XCL' ，'EGF VI IGFBP-I HIF-la mTOR
RAGE ATF-6 iDl'SPl PD-L1 IREP STAT3 ITSC2 ,Racl l.TBP-2 IPTEN PERK I AMA4 MMP-2 PD-1 TSCI MMP-M CXCL9 VEGF ATF-4 HI.A-G FOXP3
注：1、2、3分别为母胎界面、绒毛、胎盘体部取材
图1 Con 组和PE 组胎盘组织差异显著基因启动子
区域DNA 甲基化聚类图
Fig 1 Cluster map of DNA methylation in promoter regions of
|)lacental tissue of Con group and PE group
2.4 STAT3基因过表达和沉默后稳定转染的细胞株
的建立 在过表达STAT3的HTR8/Svneo 、JEG-3、
JAR 、BeWo 细胞株中.Western blot 检测STAT3蛋白条
带显著高于空载体转染后的细胞.见表4。HTR8/Sv-
neo JEG-3、JAR 、BeWo 细胞在经过shBNA 转染后，进
行48小时的常规培养。Western blot 检测各组STAT3
蛋白的表达沉默结果见表5
表4 Western blot 检测细胞株STAT3基因过表达(pg/ml )
Tab 4 Detection of overexpression of cell line STAT3 by
Western blot( jxg/ml )
HTR8/Svneo
JEG-3JAR
Be Wo Con 组 2. 20 ±0. 88 2. 26 ±0. 82
2. 24 ±0. 87 2. 25 ±0. 86V ector 2. 23 ±0. 87 2. 25 ±0. 79
2. 26 ±0. 82
2. 24 ±0. 83
STAT3 0E 5. 58 ±1.34
5.63 ±1.41 5.60 土 1. 35
5.61 ±1.40t
2. 871
image pro plus3. 125
3. 232 3. 153
P 0. 024
0.0190.017
0.018
表5 Western blot 检测细胞株STAT3基因沉默(pg/ml)
Tab 5 Detection of silencing of cell line STATS by
Vi rsteni l )lot( jig/ml )
HTR8/Svneo
JEG-3JAR Be Wo Con 组
6. 24 ±1.25 6. 33 ±1.21 6. 30 ±1.30 6. 34 ±1.26
sh Vector 6. 28 ±1. 13 6. 30 ±1. 15 6. 32 ±1. 14
6. 35 ±1.07sh STAT3 3. 04 ±0.21
3.07 ±0. 18 3.06±0. 19 3. 11 ±0. 16
t 2. 899 2. 885 2. 879
2. 771P
0. 022
0. 024
0. 023
0. 028
2. 5 GST-pull down 检测 STAT3 与 PENT 、TSC2 体外
表达蛋白的相互作用STAT3与PTEN.TSC2存在相 互作用，STAT3能被GST 融合蛋白PTEN 、TSC2结合， 并且检测到STAT3、P 「EN 、TSC2都有表达，而GST 与
STAT3没有相互作用，GST 空蛋白不能将STAT3结
合,HTR8/Svneo 细胞株结果见图2。
Input
GST-pull down
IB: PTEN
1B:TSC2
IB:STAT392KD
54KD
200KD
图 2 GST-pull down 验证 HTRX/Svneo 细胞中 STAT3 与
PTEN 、TSC2蛋白体外相互作用
Fig 2 GST-pulldown validates interaction of STAT3 with pTEN
and TSC2 proteins in HTR8/Svneo
2.6 CHIP 验证转录因子STAT3与靶基因PENT 直
接结合作用 在HTR8/Svneo 、JAR 、Bewo 细胞中，
STAT3能明显富集靶基因PTEN.5-AZA-DC 干预后差
异显著，有统计学意义(P < 0. 05)，见表6。5-AZA-DC
干预后各组PCR 结果见图3
表6 CHIP 验证细胞株转录因子STAT3与靶基因PTEN 结合结果(% )
Tab 6
CHIP validates binding of cell line transcription factor STAT3to target gene PTEN(% )
5-AZA-DC(-)
5-AZA-DC( + )
HTR8/Svneo JEG-3JAR Bewo HTR8/Svneo JEG-3JAR Bewo Con 组8. 23 ±1.418. 28 ±1. 35
8. 22 ± 1.42& 25 ±1.36
8. 27 ±1.338. 26 ±1.358. 31 ±1.28& 29 ±1.26sh STAT3
4. 11 ±0.51 4. 14 ±0. 49 4. 16 ±0.42 4. 17 ±0. 388. 15 ±1.35& 12 ±1.48
& 13 ±1.42
& 18 ±1. 32
STAT3 0E 6. 52 ±1.02
6. 66 ±1.04 6. 56 土 1.03 6. 57 ±1.05
16. 15 ±1.73
16. 18 ±1.62
16. 17 ±1.65
16. 14 ±1.70
t
2. 991 2. 996 2. 871
2. 885
2. 872 2. 995 2. 674 2. 771P 0. 023
0. 022
0. 0240. 025
0. 024
0. 023
0. 031
0.
030
实用妇产科杂志2021年2月第37卷第2期Journal of Practical Obstetrics and Gynecology2021Feb.Vol.37.Vo.2
・125・
Input IgG STAT3Input IgG STAT3 PTEN
GAPDH
Input IgG R-poly Input IgG R-poly 3A:HTR8/Svneo3B:JEG-3l)NA甲基化PTEN基因发生了咼甲基化，BSP测序验证MSP甲基化分析结果。5-AZA-DC干预前shSTAT3、STAT3"组甲基化显著,5-AZA-DC干预后shSTAT3STAT3"组呈非甲基化.见图5。
Input IgG STAT3Input IgG STAT3 PTEN
GAPDH
Input IgG R-poly Input IgG R-poly
3C:JAR3D:Be Wo
%
H
V
1
S
f
H
v
H
s
吩
c
o
o
q
%
H
v
l
s
E
ls
q
s
01
c
o
H
N
p
UMUMUMUMUM UMUM U M U M
5-AZA-dC(-)5-AZA-dC(+)注：P为阳性对照组;N为阴性对照组
图3PCR验证CHIP实验中细胞株5-AZA-DC干预后
STAT3与PTEN结合
Fig3PCR confirms that STAT3binds to PTEN afler5-AZA-DC
intervention of cell line in CHIP
2.7双荧光素酶报告基因实验验证转录因子STAT3调控PTEN启动子活性pCD3/Flag/STAT3与GL3-PTEN-luc共转,STAT3oe组PTEN的启动子活性高于Con组,shSTAT3组PTEN的启动子活性低于Con组。5-AZA-DC干预后差异有统计学意义(P<0.05)，见图4
20 5 0 5 0•5-AZA-DC(-)
o5-AZA-DCC+)
4A：HTR8/Svne(»
5
•5-AZA-DC(-)
o5-AZA-DC(+)
4B：JEG-3
兰5
垢匸-Ne-Ld •5-AZA-DC(-)
O
5
e
圧
用
畐
U
N
m
l
d
•5-AZA-DC(-)
o5-AZA-DC(+)
Con组shSTAT3STAT3OB 4C：JAR4D：BeWo
①P>0.05②P<0.05
图4HTR8/Svneo、JEG-3、JAR.BeWo细胞STAT3调控
PTEN启动子活性结果
Fig4STAT3regulates PTEN promoter activity in
HTR8/Svneo JEG-3、JAR、BeWo cell lines
2.8MSP和BSP检测PTEN基因启动子区Cp G岛
图5MSP检测PTEN启动子甲基化结果
Fig5The results of MSP detection of PTEN promoter methylation
3讨论
PE是妊娠期特有疾病，可引起母体多系统器官损伤疾病，是目前导致围产期母婴高死亡率的主要原因之一*。其发病机制至今尚不明确。近来越来越多的学者认为，PE是母体对妊娠的一种过度炎性反应⑺。
研究表明胎盘功能缺陷的发生可能源于配子早期的表观遗传学异常.有观点认为表观遗传学调控异常发生在妊娠前或妊娠中均增加PE的易感"我们研究结果证实DNMT1在PE胎盘组织中表达明显高于正常足月胎盘组织,STAT3表达明显低于正常足月胎盘组织通过甲基化抑制剂处理后DNMT1表达明显下调，而STAT3表达显著上调，说明STAT3的表达程度受DNA甲基化的调控。
本研究证实，年龄和分娩时BMI两组组产妇之间差异无统计学意义。但PE组产妇的收缩压、舒张压及24小时尿蛋白均显著升高分娩孕周显著减小，新生儿出生时体质量明显偏低.差异均有统计学意义, PE组胎盘组织中STAT3、PTEN、TSC2mRNA和蛋白表达均低于Con组.而DNMT］高于Con组，其中STAT3.PTEN mRNA的表达降低更为明显，说明子痫前期发病时胎盘组织呈甲基化，促使靶基因表达水
平下降MeDIP-Seq检测我们发现这些基因启动子区域和CGI区域的聚类分析热图结果和全基因水平」致9!o另外考虑STAT3,PTEN和TSC2基因的CpG 岛位于启动子区域，故CpG岛的甲基化会使STAT3、PTEN和TSC2基因显著下调为证实STAT3与PENT、TSC2体外相互作用，我们将重组纯化蛋白His-Tag-STAT3、GST-PENT、GST-TSC2、GST进行体夕卜相互作用，将GST融合蛋白PTEN、TSC2固定在Glutathione琼脂糖珠分别与STAT3相互作用.同时用GST 空蛋白的Glutathione琼脂糖珠为对照在CHIP
中,
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