免疫组化照片密度定量分析==转载链接
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2009-11-23 21:53
Imagepro plus 应用实例2－免疫组化照片密度定量分析。
估计这是大家用得最多的，所以先讲这个了。
免疫组化技术现在是很成熟的方法，但是对免疫组化照片的分析并没有一个权威的说法。现在可以查到无数篇应用图像分析来分析免疫组化的文献，但几乎没有哪一篇能详细地叙述分析的过程与方法。
首先，免疫组化的样品应该是用ＤＡＢ对免疫组化产物染，同时用苏木对细胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝，胞浆间有黄（强阳性的地方会呈现棕黄）。居然经常能看到其他颜的免疫组化照片，这肯定是样品制作过程中有了差错。
用肉眼观察免疫组化切片的结果只能是定性的，不准确的。使用图像分析软件定量地（至少是半定量）对照片测量出一个数值来自然比用肉眼看更准确。
切片上阳性反应物量是由图片上黄染的深浅与面积一起表现的。所以最终要测量的就是图片上黄部分的累积光密度（IOD），这是个没有单位的相对数值。就是把图片上每个黄的象素点的强度值全部累加起来得到的值。
IOD除以一个适当的面积，就是一个平均光密度。这个面积可以就是照片的面积，也可以是照片上一个组织区域的面积，或者是有黄的区域的面积。必须根据切片的实际情况来适当选择。
对于细胞核的免疫组化切片，在细胞核上，由于有蓝复染，所以需要另一种分析方法。将另作讲解。
这张照片曝光稍大。但仍能表现出免疫组化的黄染与细胞核的蓝染。
在拍摄照片时，需要注意的地方是：
１.所有的照片必须以同样的显微镜环境与拍摄条件来拍摄。在拍摄照片时，要保持显微镜光源亮度的稳定，用同样的曝光时间拍摄照片。在更换视野或切片时，除了对焦距这个操作外，其他所有的操作都不能有变化。强阳性的样品就是暗的黄的，弱阳性的样品则亮一些，阴性样品就是一片白。这样才能测量出正确的密度值。
２.曝光的选择：试拍摄一张空照片，看一下白背景的亮度，应该在２３０附近。过低过高都不好。
3.注意相机白平衡：如果使用的是专业CCD相机，会有校正白平衡的功能，此时应对空视野进行白平衡校正。如果是普通的数码相机，要关闭自动白平衡功能。或者选择阳光模式。避免拍摄的照片因为偏而偏蓝或偏黄。
4.很多显微镜都是同时有荧光附件的，在拍摄荧光照片时要加上滤光片，注意有时候这些滤光片会忘了移开，结果拍摄的照片就会严重偏。
正确地拍摄照片是图像分析的基础，以后的各项应用实例中往往都会先介绍如何拍摄照片。
图像分析方法：
1.校正图片光密度
分析免疫组化照片，第一步就是要校正光密度。照片上黄点的亮度数值是灰度，黑为0，白为255.这与免疫组化强度是相反的。深深的点，数值应该更大才对。在理论上，图片上的灰度与样品阻挡光线的物质光密度是一个指数关系，对于白的点，对应样品透光率为100%，光密度为零。对于黑的点，对应样品透光率为0，光密度为无穷大，但实际上把这个光密度值定为2.0.校正光密度值就是把程序的光密度值设置成这样的坐标。
在carliberation intensity的窗口里点new,然后选择std option density.
把鼠标放在图片上最白的地方，然后看程序窗口下方的状态栏，会有显示该点的三各自的灰度值，在其显示的数值中间选择一个差不多的整数，比如230，或220，作为背景扣除值。操作方法是：点option按纽，在弹出的小窗口中的incident level中把默认的255改为230或220.返回就可以了。
最后在窗口右上方点一下system把这个校正作为系统光密度值应用于所有图片。这个设定被默认地命名为intensity cal 0 。光密度校正的窗口不要关闭，可以移到边上放着随时检查。有时候新照片未必会应用上，要重新调出刚才设定的intensity cal 0.
2.选。
在segmentation中使用HSI模式，选择H:0-30,S:0-255,I:0-230.然后点file -- save。HSI的选择范围是可以根据图片情况作微调的。保存这个选设置。一般放在图片的保存文件夹里。默认的保存文件是。
3.设置分析环境。
一个是select measurement。要选择IOD。另外默认的选择area都是要测量的。对area的过滤值，默认为10，实际上还可以大点，设置到25甚至50也行，可以把那些小的杂质点去掉。
另一个是option:
outline :filled
label style :none
dark background on sample :no
smoothing=1
filled hole:on
clean border : none
4.保存分析环境。
在count/size窗口中点file save settings。保存环境设置文件。
5测量
用irregular工具画出测量区域。
这里很关键的一点就是如何画这个测量区域。
最普通的情况下，要测量整张照片的光密度，就不必画这个测量区域了。此时会测量照片上全部被选中的黄的光密度总和（IOD SUM），面积就是照片的面积。
如果你拍摄的照片上，有个角正处于切片边缘，没有细胞，这就需要把这个角上的空白面积给扣掉了，此时画的“测量区域”就应该沿着样品的边缘来画。
另一种情况是，要测量一个癌巢里的蛋白表达，边上正常组织上的表达不算。这时候就要沿着这个癌巢的边界画这个“测量区域”。
点count按纽。完事。测量数据在view statistics窗口中，读取IOD SUM数值，作为这张照片的累积光密度值。其他的数值都是没用的。
如果你用irregular工具画了一个“测量区域”，那点count时，程序会只测量“测量区域”内的IOD。外面的不管。
在测量数据中显示的area是黄部分的面积。在很多情况下，这个面积值意义不大。
6.测量面积。
通常我们需要测量的是一个平均光密度（mean density）而不是积分光密度(IOD)。上一步已经测量了IOD，现在就要测量area了，再说一遍，上一步的测量数据里的area在通常情况下并不是正确的area。
如果测量的是整张照片，area就是照片的面积。如果用irregular画了“测量区域”，area就是这个测量区域的面积。此时只要在count/size窗口中点edit - convert AOI to object，然后就能在测量数据窗口中看到测量面积了。此时还能看到另一个IOD值，这个值是不能用的，它包括了蓝细胞核的光密度。
7.数值处理：
对每一张照片，要测量一个IOD SUM ，如果选择了测量区域，还要测量一个area。
这张照片的测量值一般是平均光密度，它反映了这张照片上免疫反应物的表达强度。
mean density = (IOD SUM) / area
在测量整张照片的时候，可以只测量IOD SUM ，在这种情况下，所有照片的面积都是相等的。
mean density 与 IOD 都是个相对值，所以是没有单位的。其实OD值本身就是个比例值。这个词在分光光度计上常用，意思是optical density
通常我们有两组实验对象，实验组与对照组，每组有十来个样品，各拍摄几张照片。
每个样品拍摄的几张照片测量的mean density再作一次平均，作为这个样品的mean density.
一个实验组的几个样品测量值可以计算其平均值与标准差，或者直接用T检验去统计两组的统计学差异。
把一张照片的测量值当作一个数据也是可以的。
再次强调，一张照片只测量一个IOD值或mean density值，作为这张照片的测量数据。statistics窗口中的其他统计数值不必管它。
8.批量测量照片：
测量一组照片时，首先用一张比较典型的照片按上面步骤测量。然后在测量其他照片时，必须用这些测量条件来测量。因为已经保存了背景校正、选文件与测量环境文件，所以在测量时要直接调用这些设置文件。
8.1 把第一张照片最小化，不要关闭。
8.2 打开第二张照片，或者一次打开全部照片，激活一张。
8.3 检查光密度校正窗口，确认应用了光密度校正。
8.4 在count/size中load settings，调出环境设置文件。
8.5 点select color 调出segmentation窗口。确认处于Histograph及HSI模式下。再调出选文件。
8.6 需要时用irregular画测量区域。
8.7 点count 测量IOD，记录数据（点statistics中的DDE to excel），再点 convert AOI to object 测量面积，再记录数据（还是点statistics 里的DDE to Excel，注意，这是两次向image pro plusexcel输送数据，所以事先要在DDE option中选择append data to end，否则后面的数据会冲掉前面的）。
8.8 关闭图片，再测量下一张。
9.上面的测量步骤有个系统误差。在测量IOD的时候是直接测量彩照片的IOD，虽然对测量结果影响不大，如果希望测量得细致一点，就需要增加一个将彩图片转换成黑白图片的步骤。方法是：
在选择完颜后（就是上面的8.5之后），在segmentation窗口里的view下面选择transparant on white.可以看见图片上除了黄外，其他地方都变成白了。
然后点 create preview image复制这张效果图片。
转换这张图片为8位灰度格式（grey scale 8）。
在这张灰度图片上用irregular画测量区域（就是按照上面的8.6以后继续作）。
对灰度图片还要再作一次选，此时select color 按纽会变成 select ranges，只有一个 I 可以选择，此时选择范围是0-240 。
这回的IOD测量值与稍大一点。这是正确的光密度测量值。但操作上增加了很多步骤。也不便于编制宏操作进行测量。
10.下面是一个关于免疫组化照片分析原理与方法的讲座PPT。

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