细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell Mol lmmunol)2021, 37(5)391
.论著.文章编号：1007-8738(2021)05439145
AcCystatin减轻卵清蛋白诱导的小鼠变应性鼻炎病变和促炎细胞因子分泌
王黎源、袁圆\王伟2，李徽徽、吴玥\李坤龙\李丁茹、徐宇\梁金宝、郑欣\王姓\王馨\徐伟\拥、永诚1，杨小迪1=11r蚌埠医学院基础医学院安徽省感染与免疫重点实验室，安徽蚌埠233030; 2蚌埠医学院第一附属医院 耳鼻喉科，安徽蚌埠233000)
[摘要]目的观察广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（ACystatin)对卵清蛋白（OVA)诱导的变应性鼻炎小鼠的影响。方法将24只8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组、OVA变应性鼻炎致敏组和灰Cystatin组。OVA组以OVA为变应原，氢氧化铝为佐剂进行腹腔注射，第15天后O VA滴鼻建立小鼠A R模型；如Cystatin组在致敏时腹腔注射30叫AcCystatin，并在第15天后将含有O VA的混悬液中溶人IC ystatin滴鼻；对照组均以PBS替代OVA。末次滴鼻激发后，按照生物学评分标准对3组小鼠的症状进行评分，H E染观察小鼠鼻黏膜的病变情况，EUSA检测小鼠血清OVA-IgE、白细胞介素4(11^)、几-5、11^、亿-10和7干扰素（1[心1)的分泌水平。结果与对照组相比，〇V A组小鼠生物学评分明显增加，/IcCystatin组小鼠生物学评分较OVA组明显降低。镜下观察OVA组小鼠鼻黏膜纤毛明显脱落，杯状细胞增生，基底膜增厚、组织水肿且黏膜下小血管扩张，而也Cystatin组小鼠鼻黏膜病变明显减轻。同
时OVA组血清中OVA-IgE、IL4、IL-5、IL*6水平较对照组明显升高，IL-10水平降低；与O VA组相比，AcCystatin组OVA-IgE、IL4、IL-5、IL<6和IL-10水平显著降低。结论IC ystatin减轻OVA诱导的小鼠变应性鼻炎病变和炎性细胞因子分泌。
[关键词]变应性鼻炎；广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂M cCystatin)；卵清蛋白；细胞因子
[中图分类号]R765.21, R392.12 [文献标志码]A
Angiostrongylus cantonensis Cystatin (AcCystatin) alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis lesions and inflammatory factor secretion in mice
WANGLiyuan1,YUAN Yuan', WANG Wei2,LI Huihui1 ,WU Yue1,U Kunlong1,LI Dingru1 ,XU Yu1, LIANG Jinbao1,ZHENG Xin1,WANG Ya1,WANG Xin1,XU Wei1,SUN Yongcheng1,YANG Xiaodi1*
1Anhui Key Laboratory of Infection and Immunity, School of Basic Medicine, Bengbu Medical College, Bengbu 233030 ；2 Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital, Bengbu Medical College, Bengbu 233000, China
* Corresponding author, E-mail：yxd_qf@ 163. com
[A b stract ] Objective To observe the effect of Angiostrongylus cantonensis Cystatin (>AcCystatin) on ovalbumin (OVA)- induced allergic rhinitis in mice. Methods A total of 24 female BALB/c mice aged 8 weeks were randomly divided into 3 groups, including a control group, an OVA/AI (O H)3-induced allergic rhinitis group (OVA group) and an >AcCystatin treatment group. The OVA group received intraperitoneal injection using O V A/A I(O H)3suspension, and then local excitation was intranasally induced with OVA solution to establish allergic rhinitis model. In the AcCystatin group, 30 pg AcCystatin was injected intraperitoneally at the time of sensitization, and intranasal treatment was performed with suspension of OVA and >AcCystatin after the 15th day. Mice in the control group were given PBS instead of OVA. Following the final challenge, the behavioral score was evaluated in each group；pathological changes of nasal mucosa were observed by HE staining；and serum levels of OVA-lgE, IL^, IL-5, IL-6, IL-10 and IFN-y were detected by ELISA. Results Compared with the control group, the behavioral score in the OVA group significantly increased, and those in the >AcCystatin group were obviously
收稿日期：2020~09~01；接收日期：2020-1242
基金项目：国家自然科学基金（81441120)；国家级大学生创新创业计划（201910367051，201910367002 , 201910367021)；安徽省高校学科（专业）拔尖人才学术资助项目（gxbjZD15)；安徽
省学术和技术带头人及后备人选科研活动经费资助项目（2018H174)；蚌埠医学院科技发展
基金（BY K H853)
作者简介：王黎源（1986 -)，女，安徽界首人，讲师，硕士
T el：156****9500；E-m ail：*********************
* 通讯作者，杨小迪，E-m ail:y x d_q f@163. com
lower than the OVA group. Microscopically, the OVA mice showed obvious loss of nasal mucosal cilia, goblet cell proliferation, basement membrane thickening, tissue edema, and submucosal small vessel dilation, while the nasal mucosal lesions of the >AcCystatin group were obviously alleviated. The serum levels of OVA-lgE, IL^, IL-5, IL-6 in the OVA group were significant higher than those in the control group, while the IL-10 was lower. Compared with the OVA group, the levels of OVA-lgE, IL-4, IL-5, IL-6 and IL-10 were significantly lower in the /AcCystatin group. Conclusion AcCystatin alleviates OVA-induced allergic rhinitis lesions and the secretion of proinflammatory factors in mice.
[Key words] allergic rhinitis；Angiostrongylus cantonensis Cystatin (>AcCystatin) ；ovalbumin；cytokine
392 细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Immunol)2021，37(5)
变应性鼻炎（a l l e r g i c r h i n i t i s, A R)是机体暴露于 致敏原后因免疫反应失衡引发的由IgE介导、并由多 种细胞因子和炎性递质共同参与下引发的慢性炎症 反应[1~。其发病机制复杂，临床常用的药物虽 能暂时缓解症状，长期却无法根治[3]。因此，寻安 全、有效的策略显得尤为重要。
近年来，随着“卫生假说”的提出[4]，发现寄生虫感染与宿主之间存在着复杂的免疫调节关系[5]，大量实验室研究和流行病学分析证实慢性寄生虫感 染可抑制包括A R在内的过敏性疾病的发生和发展[M]，两者之间呈负相关[8_"]。但是寄生虫所导致 的病理损伤限制了其临床应用。
既往研究中在寄生性线虫中发现的半胱氨酸蛋 白酶抑制剂（Cystatin)在干预抗原呈递、细胞凋亡、T细胞的应答反应、细胞因子的生成及炎症的发生发 展过程中发挥一定的免疫调节作用[m4]。广州管圆 线虫awto/ie/wis, 4c)的成虫寄生于鼠 类肺部血管、幼虫偶尔寄生于人体，H e等[15]采用广 州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（ICystatin)重组 蛋白免疫小鼠后诱导机体引起抗体应答，产生一定 的免疫调节效果。Ji等[12]的研究证实AcCystatin可缓 解过敏性哮喘大鼠的炎症反应和气道高反应性。由于过敏性哮喘和A R均是由IgE介导的以2型辅助T (T helper type 2, Th2)细胞免疫反应占优势的I型变 态反应性疾病，且目前在利用寄生虫及其衍生物对A R 进行干预的研究较少，因此本研究使用^Cystatin对卵 清蛋白（ovalbumin, O V A)诱导的A R小鼠进行干预，观察对A R小鼠的影响，并初步分析引起的免疫学机 制，为早日进人临床试验提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料
24只8周龄雌性B A L B/c小鼠，无特定病原体 (specefic pathogen free, SPF)级，体质量 18 ~22 g，由蚌埠医学院动物中心提供，小鼠在室温20 ~26 t
环境下颗粒饲料喂养，自由饮食、饮水。O V A购自 Sigma公司；OVA-lgE购自Biolegend公司；白细胞介 素 4( interleukin 4，IL~4)、IL-5、IL~6、IL-10 和-y干扰素（interferon 7, IFN-7) ELISA检测试剂盒购自深圳 达科维公司；谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S- transferase，GST)标签蛋白纯化试剂盒购自B D公司；去内毒素试剂盒购自Thermo Scientific公司；二辛可 宁酸（bicinchoninic acid, B C A)蛋白浓度检测试剂盒 购自Pierce公司；异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-p-Z)-thiogalactoside，IPTG )购自索莱宝公司。常规试剂均为分析纯产品。电子天平购自Mettler Toledo公司；生物显微镜购自Olympus公司；酶标仪 Model550 购自 Bio-Rad 公司。重组质粒 pGEX4T-l-/lc- Cystatin由中山大学医学院吕志跃教授惠赠。
1.2方法
1.2.1 重组蛋白AcCystatin的表达、提纯及去内毒 素将pGEX4T-l -ICystatin重组质粒经过钙转染法 转化
大肠杆菌BL21/D E3后，30丈条件下，0.8 mmol/L IP T G诱导4 h。收集细菌，按照试剂盒 说明书使用G S T标签蛋白纯化试剂盒进行纯化，并 依次经酶切、S D S-P A G E鉴定纯化效果后，去除纯化 蛋白内毒素，使蛋白中内毒素含量<〇.〇5内毒素单 位(endotoxin unit, Eu)/mL, B C A法测定纯化蛋白浓 度，经S D S-P A G E鉴定后分装冻存于-80 备用。1.2.2 实验分组及处理将24只B A L B/c小鼠随 机分为对照组、O V A组和ZlcCystatin组，每组8只。基础致敏时，O V A致敏组每只给予50网O V A和 4m g[Al(O H)3]溶于200 p L P B S腹腔注射小鼠；AcCystatin 组每只给予50 (x g O V A、4 mg [A1 (0H)3]、30 |x g/IcCystatin 和 200 |xL PBS 腹腔 注射，对照组均以P B S替代。以上步骤均隔日1次，共7次。在造模第15天行激发致敏，使用水合氯醛 麻醉小鼠后，O V A组使用含有50 g/L O V A的PBS 20 j j l L滴鼻；AcCystatin 组以 50 g/L O V A 和 20 (x g ZlcCystatin的P B S混悬液20 p L滴鼻激发；对照组用 P B S替代。以上3组均每天1次，连续7 d。
1.2.3生物行为学评价标准末次激发后，对3组 小鼠进行行为学观察30 min，按照挠鼻频繁程度、喷 嚏次数和流涕等生物学行为进行症状评分，总分>5分 表示造模成功。无症状为〇分，单前肢偶尔挠鼻、喷
U S_王黎源，等.IC ystatin减轻卵清蛋白诱导的小鼠变应性鼻炎病变和促炎细胞因子分泌393
嚏1 ~3次、流涕至前鼻孔1分，双前肢频繁挠鼻、喷嚏4 ~ 10次、流涕超过前鼻孔2分，双前肢抓挠不 止、喷嚏>10次、涕流满面3分。
1.2.4 H E染检测小鼠鼻黏膜病变情况小鼠脱颈处死，去除鼻部附着肌肉组织，用甲醛溶液固定整 体骨性鼻腔，脱钙后石蜡包埋，常规切片，厚度 4 p m。采用H E染观察鼻黏膜的整体炎症变化和 结构重塑情况。
1.2.5 ELISA 检测血清中 OVA-IgE 和 IL4、IL-5、IL>6 IL-10和IFN-7水平小鼠末次激发24 h后，摘 眼球取血，室温下静置30 min;3000 r/min离心 15 min，收集血清待检。ELISA检测OVA-IgE、I L4、IL-5、IL*6 IL-10 和 IFN-7 的水平，严格按照 ELISA 试剂盒进行操作。
1.2.6统计学分析采用统计软件SPSS18.0处理 实验数据，组间均数采用单因素方差分析（两组之间 比较采用Newman-Keula,^检验），各组数据使用 王土s表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 /IcCystatin处理降低OVA致敏小鼠的生物行为学计分
对照组平均分是(1.75 ±0.707)分；O V A组小鼠喷 嚏及水样清涕较多，挠鼻频繁，所有小鼠评分>5分，平均计分为（5_625 ±0. 5H)分，提示造模成功；/IcCystatin组平均计分是（3. 25 ± 1•035)分，三组小 鼠的生物学行为评分具有统计学意义(P <0.05)，说 明也Cystatin处理能降低O V A致敏小鼠的生物行为 学计分。
2.2 AcCystatin处理减轻O V A致敏小鼠鼻黏膜病变
对照组小鼠鼻黏膜结构完整，纤毛排列较整齐，上皮细胞排列均勻，基底膜无水肿和血管充血，见少 量炎症细胞浸润；O V A鼻炎组小鼠鼻黏膜纤毛明显 脱落，杯状细胞增生，基底膜增厚、组织水肿且黏膜 下小血管扩张。与O V A致敏组相比，AcCystatin组小 鼠鼻黏膜结构较完整，纤毛较整齐，基底膜水肿和血 管充血现象也有所改善（图1)。
A：对照组；B: OVA 组；C: ■AcCystatin 组.
图1小鼠鼻黏膜形态（HE染，x400)2.3 AcCystatin处理降低O V A致敏小鼠血清OVA-IgE和 IL4、IL-5、IL"6 和 IL-10 水平
利用ELISA检测小鼠血清中OVA-IgE和细胞因 子分泌情况。结果显示，与对照组相比，O V A组小 鼠血清中的OVA-IgE和细胞因子I L4、IL-5、IL"6水 平明显升高，IL-10水平降低，差异均具有统计学意 义（P<0.05)，3组小鼠血清IFN-7水平变化不明显，差异无统计学意义。与O V A致敏小鼠相比，AcCystatin 组小鼠血清中 OVA-IgE、I L4、IL-5、IL6 和IL-10水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。
aP<0.05, bP<0.01对照组；dP<0.01us OVA 组.
图2 ELISA 检测小鼠血清 OVA-IgE、IL4、IL-5、IL4、IL-10、IFN-y水平
3讨论
A R是一种由环境和遗传因素共同作用下引发的 慢性炎症反应，该病与哮喘密切相关[16]，严重影响 患者的生活质量。目前认为其发病机制是由IgE介 导并与嗜酸性粒细胞[17]、中性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞相关，由于其免疫反应失 衡引发鼻黏膜T h2细胞反应占主导，通过检测血清 中相关细胞因子及特异性I g E的表达水平可直接反 映A R的炎症程度。近年来大量研究表明，机体感染 寄生虫后通过其分泌的虫源性分子和衍生物可诱导 免疫细胞的活化，并可调节过度的免疫反应所致的 病理损伤[18]，形成有利于其寄生的微环境[1〜，从而 对过敏性疾病的发生和发展起到一定的调控作用[8]。
在这些虫源性分子中，包括如在内的寄生虫Cystatin被证实在逃避宿主免疫应答并适应寄生生活 中起重要作用[2<W1]。其主要机制是通过干扰抗原提 呈、调节生成细胞因子和T细胞应答等实现免疫调 节作用。
本研究中我们以O V A为致敏原、氢氧化铝为佐 剂对小鼠进行腹腔注射和滴鼻诱导A R模型，利用 ICystatin对该模型进行干预并观察其作用。结果显 示：与对照组相比，O V A致敏组小鼠生物行为学评 分增加，镜下观察该组因过度炎症而导致明显的鼻 黏膜病理重塑，且血清中OVA-IgE、I L4
、IL-5和
394细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Inmum〇l)2021, 37(5)
I L4分泌明显增多，符合A R的症状和特征。而经过 ICystatin干预后的小鼠，小鼠生物行为学评分明显 下降，鼻黏膜结构较完整，纤毛排列较整齐，基底膜 水肿和小血管充血得到改善。血清检测中显示OVA- IgE水平明显下降，该结果在Pascoal等[22]用/l C的可 溶性提取物（The t o t a l soluble extract, T E)控制过敏性 哮喘气道炎症的研究中亦得到证实，其主要机制是 寄生虫及其衍生物刺激机体产生高水平的寄生虫特 异性IgE和血清总IgE[23]，与肥大细胞的IgE受体结 合后，可竞争性阻断〇VA-IgE与肥大细胞及其他可 导致过敏性炎症细胞的结合，从而减轻过敏反应的 症状[24_251。同时灰Cystatin组血清中I L4、IL-5和 I L4的分泌也有所下降；IL4作为典型的Th2诱导 细胞因子，可促进过敏原[26]的刺激而导致I g E的产 生；IL-5与嗜酸性粒细胞和气道高反应性密切相关，与IL*4产生协同作用，使黏液分泌增多，并刺激炎 性细胞向局部组织浸润，进一步促进炎症的发生和 发展[27]。几名抑制T h l细胞和调节性T细胞(regulatory T ce l ls, Treg)的分化[28]，通过上调黏附 因子表达参与多种白细胞黏附与集聚，从而加强炎 症反应，其高表达对气道炎症的产生和气道结构重 塑起重要作用。实验结果表明在ICystatin的干预下 减轻了由I L4、IL-5和I L4引起的气道高反应性，并 缓解了炎症的发生和发展。但在本研究中，我们发 现3组小鼠血清中的IFN-7的分泌水平并未发生显 著变化，和S u n等[M]的研究结果相似，表明T h l细 胞可能不参与缓解O V A引起的过敏性炎症。同时 IL-10作为一种免疫性调节细胞因子在如Cystatin治 疗组血清中的分泌也有所下降，这一结果在
的研究中亦得到证实，即旋毛虫对 小鼠过敏性气道炎症具有保护作用，且肺泡灌洗液 中IL-10表达降低，
进一步将慢性旋毛虫感染小鼠脾 脏的C D4+T细胞过继转移至过敏性气道炎症的小鼠 后亦使IL-10分泌减少；此外，关于曼氏血吸虫对过 敏性哮喘小鼠的报道中也证实CD4 +CD25+ T细胞的 关键作用与IL-10并无明显关系[31]。
目前，寄生虫Cystatin已被证实可显著抑制多种 过敏性及自身免疫性疾病的炎症反应，如哮 喘[12’22]、炎性肠炎、脓毒症[32]等。在本研究中我们 也证实/IcCystatin作为一种免疫调节分子对由OVA 诱导的A R的作用，这与减少变应原特异性的 T h2细胞反应有关，通过下调I L4、IL-5和I L4等炎 性因子的释放，以及竞争性阻断OVA-IgE与导致过 敏性炎症细胞的结合，可有效改善A R的炎症反应，从而减轻过敏反应的症状。但寄生虫Cystatin的具体调节机制较复杂，还需继续深人研究，以期为将来在 科研和临床应用提供更可靠、安全的证据。
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