实验三：多条序列比对——Clustalx
（一）ClustalX
Clustal是一种利用渐近法（progressive alignment）进行多条序列比对的软件。即从多条序列中最相似（距离最近）的两条序列开始比对，按照各个序列在进化树上的位置，由近及远的将其它序列依次加入到最终的比对结果。（Figure 3.1）
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1. 安装clustalx程序。
双击安装clustalx-2.0.文件到自己的电脑上。
也可从/download/current/下载，列表中的倒数第二个文件。clustalx-2.0.12-win.msi
Figure 3.1 clustal 算法
2. 准备要比对的序列
请查至少存在于5个物种中的同源序列（核酸或蛋白质皆可），并保存为fasta格式，存为文本文件（所有的序列请粘贴到同一个文本文件中）。选择NM、XM或NP打头的序列，不要选择NC或NW打头的序列，那是全基因组序列。
做法可参照邮箱中的preparations for practice3.doc文件。
3. 打开clustalX程序
开始菜单－程序－clustalX2- clustalX2
4. 载入序列
点最上方的File菜单，选择Load Sequence-选择你刚保存的序列文件，点打开。
在左侧窗口里是fasta格式序列的标识号，取自序列第一行“>”后的字符。(Figure 3.2)
注意：ClustalX程序无法识别汉字，无法识别带空位的文件夹名，如 my document。各位同学保存的序列文件不要保存在桌面上或带汉字的文件夹中，推荐保存在D盘根目录下。
常见文件打开错误原因：
1． 序列格式有问题，非正确的fasta格式。
2． 文件中有序列重复粘贴。
TIPS: 想要方便识别序列所属物种，可在每条序列“>”后输入物种名，加空位即可。
EXAMPLE：原格式：>gi|262050536|ref|NM_002218.4| Homo sapiens inter-alpha (globulin) inhibitor H4 (plasma Kallikrein-sensitive glycoprotein) (ITIH4), transcript variant 1, mRNA
改为：>human gi|262050536|ref|NM_002218.4| Homo sapiens inter-alpha (globulin) inhibitor H4 (plasma Kallikrein-sensitive glycoprotein) (ITIH4), transcript variant 1, mRNA
Figure 3.2 载入序列
5. 比对参数的选择
可以对两条序列比对的参数和多条序列比对的参数进行设置。
a. 两条序列比对的参数设置
点击Alilgnment菜单，选择Alignment Parameters,再选择Pairwise Alignment Parameters,得到Figure 3.3.首先可以选择比对的效果，是slow/accurate 还是fast/approximate。第一种模式采用的是动态规划算法进行比对的，第二种模式采用的是启发式的算法。除非序列非常长，一般采用第一种模式。可以选择空位罚分系统，要使用的DNA或蛋白质替换矩阵，也可以自己上传某个替换矩阵进行比对。
Figure 3.3 Pairwise Alignment Parameters
b. 多条序列比对参数设置
点击Alilgnment菜单，选择Alignment Parameters,再选择Multiple Alignment Parameters,得
到Figure 3.4.
Figure 3.4 Multiple Alignment Parameters
Delay divergent sequence是指当两条序列的差异大于某个值（百分比）的时候，这两条序
列的比对将推迟进行，它们的比对结果会在最后加入到最终的多条序列比对结果。DNA transition Weight等于0的时候，程序将转换（transition）当作错配(mismatch)看待，等于1的时候，将转换(transition)当作颠换(transversion)看待。当参与比对的序列差异较大时，DNA transition Weight应该选择的小些（接近0），如果参与比对的序列差异较小时，DNA transition Weight可选择的大些（接近1）。
6. 更改输出格式
点击Alignment菜单，选择Output Format Options，页面如Figure 3.5 。
默认的是输出clustal format,如果需要其它格式，可在复选框里打勾。PHYLIP格式是利用PHYLIP软件进行建树时，需要输入的格式,我们将在实验6系统发育树构建中用到。
Figure 3.5 输出格式选项
7. weight可不可数进行比对
点击Aliglnment菜单，选择Do Complete Alignment.此时出现一个对话框，提示你比对结果保存的位置，你在上一步选择了多少种输出格式，这里就会给出多少个文件的路径。选择好了点OK即可。
要得到理想的比对结果，你可能需要选择不同的参数，进行多次比对，最后再对各种比对结果进行分析，选择哪个是最合理的结果（the result making biological sense）。
比对结束后生成的aln文件是多条序列比对的结果，可以用记事本打开浏览(Figure 3.6)。在某一列比对结果下方如果出现*，说明这列是完全匹配。dnd文件是比对过程中生成的进化树，可以用treeview（压缩包中的treev32.rar文件）打开浏览(Figure 3.7)。
Figure 3.6 记事本打开生成的aln文件

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