呼吸道病毒多重核酸检测试剂-医疗器械技术审评中⼼
附件1
呼吸道病毒多重核酸检测试剂
技术审查指导原则
（征求意见稿）
本指导原则旨在指导注册申请⼈对呼吸道病毒多重核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。
本指导原则是对呼吸道病毒核酸测定试剂的⼀般要求，申请⼈应依据产品的具体特性确定其中内容是否适⽤，若不适⽤，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进⾏充实和细化。如申请⼈认为有必要增加本指导原则未包含的研究内容，可⾃⾏补充。
本指导原则是供申请⼈和审查⼈员使⽤的指导⽂件，不涉及注册审批等⾏政事项，亦不作为法规强制执⾏，如有能够满⾜法规要求的其他⽅法，也可以采⽤，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使⽤本指导原则。
本指导原则是在现⾏法规、标准体系及当前认知⽔平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进⾏调整。
⼀、范围
呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）是⼈类最常见的⼀类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发⽣，是
全球范围内引起⼈发病和死亡的最主要原因之⼀。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为⿐炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起⽓管炎、⽀⽓管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其⽅法、疗效和病程也不尽相同。⽬前已证明，⼤部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。
本指导原则适⽤于呼吸道病毒多重核酸检测试剂，适⽤样本类型应为⿐咽拭⼦、咽拭⼦、肺泡灌洗液、痰液或其他呼吸道分泌物样本等。检测对象应可引发相似的临床表现，可包括但不限于：
甲型流感病毒、⼄型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、⼈偏肺病毒、腺病毒、呼吸道感染肠道病毒（肠道病毒/⿐病毒）、冠状病毒、博卡病毒。
本指导原则适⽤于利⽤荧光探针聚合酶链式反应（Real-time PCR）或其他分⼦⽣物学⽅法，以特定的
呼吸道病毒基因序列为检测⽬标，对来源于⼈体样本中的呼吸道病毒核酸进⾏体外定性检测，临床⽤于辅助诊断呼吸道病毒感染相关性疾病。涉及其他临床⽤途的呼吸道病原体核酸检测试剂可参考本指导原则。
⼆、基本要求
（⼀）综述资料
综述资料主要包括产品预期⽤途、产品描述、有关⽣物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其他内容，其中其他包括同类产品在国内外批准上市的情况。与预期⽤途相关的临床适应症应重点描述呼吸道病毒型别与临床适应症的相关性及相关病毒在我国的流⾏特征；产品
描述应明确申报产品所有可检出的病毒型别、尚未验证的病毒型别，陈述应科学、客观且有依据；与国内外同类产品的⽐较内容应着重从⽅法学、病毒种类及基因型检出能⼒、检出限等⽅⾯进⾏⽐较。应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家⾷品药品监督管理总局令第5号）和《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》（国家⾷品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。
（⼆）主要原材料的研究资料
此类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分（如有）、企业参考品、质控
品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备过程、质量标准等的相关研究资料、质控品的定值、赋值试验资料等。如主要原材料为企业⾃制，应提供其详细制备过程；如主要原材料源于外购，应提供的资料包括：选择该原材料的依据及对⽐试验资料、供货⽅提供的质量标准、出⼚检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。
1.引物和探针：应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。建议每种病毒设计两套或多套引物、探针以供筛选，针对所有预期适⽤的病毒种类及基因型别进⾏检出能⼒和特异性（如交叉反应）的评价，选择最佳组合，并提交筛选的研究数据。引物、探针的质量标准应⾄少包括序列准确性、纯度、浓度及功能性实验等。
如为外购，引物应提供合成机构出具的包括如上性能的质检证明，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）结果或⾼效
液相⾊谱法（HPLC）分析图谱。探针应提供合成机构出具的合成产物的质检证明(HPLC分析图谱)；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进⾏核实，并作HPLC分析。
2.脱氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，应提供对其纯度、浓度、功能性等的详细验证资料。
3.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶等，应分别对其酶活性等进⾏评价和验证。DNA 聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，⽆核酸内切酶活性，具热稳定性；逆转录酶，具逆转录酶活性，⽆核酸内切酶活性，应提供有关保存稳定性、活性及功能实验等的验证资料；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，⽆核酸外切酶及核酸内切酶活性，应对酶活性有合理验证。
4.试剂盒内质控品
试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品（质控品）来实现，其参与样本核酸的平⾏提取，以对整个PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进⾏合理质量控制。质控品浓度及成分的设置应与待测样本相近。申报资料应对试剂盒对照品有关原料选择、制备、定值过程、浓度范围等试验资料详细说明。
4.1阴性质控品应不含试剂盒所检测的靶序列，参与样本处理和检测的全过程。以对可能存在的交叉污染产⽣的假
阳性结果或扩增反应中背景值进⾏质量控制。阴性质控品可来⾃⾮呼吸道病毒感染的患者样本、假病毒、含⾮靶向序列的⽣物样本（如⾮呼吸道病毒感染的细胞系）。建议采⽤与实际检测样本具有相同或相似性状的基质溶液作为阴性对照（质控）品，不推荐采⽤⽔作为阴性对照（质控）品。
4.2阳性质控品
4.2.1全过程阳性质控品应参与样本处理和检测的全过程，如核酸的平⾏提取等步骤。全过程阳性质控品可⽤1～2个病毒株为代表，应含有天然的或⼈⼯合成的包含试剂盒可检测靶序列，可来⾃灭活病毒、假病毒、疫苗或原型疫苗株、低致病性病毒、病毒株感染的细胞系等。企业应对质控品的检测结果（如Ct值）做出明确的范围要求。
4.2.2扩增/检测⽤阳性对照品可为浓度在最低检出限附近的纯化靶核酸，以对检测过程进⾏质量控制。
4.3内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进⾏质量控制，应与靶核酸⼀同提取及扩增，申请⼈应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线⼜要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。对内对照的检测结果（如Ct值）亦应做出明确的范围要求。内标可设置为与待测病毒共提取的⼈核酸或⼈管家基因（如RNaseP、β-肌动蛋⽩）。
5.企业参考品：应详细说明有关企业参考品的原料选择、制备、阴阳性确认等试验资料。企业参考品的核酸性质应与
产品预期检测的靶物质⼀致。建议企业参考品优先采⽤病毒培养物，如病毒难以培养，RNA病毒可采⽤假病毒、⼈⼯克隆或合成的呼吸道病毒基因组RNA，DNA病毒可采⽤克隆细菌等。
5.1阳性参考品和阴性参考品
阳性参考品应覆盖申报产品声称可检出的所有呼吸道病毒亚型（详见表1）。阴性参考品应考虑检测特异性的评价，应纳⼊不在试剂盒检测范围内的其他呼吸道病原体样品。
5.2检测限参考品
申请⼈应明确检测限参考品中病毒核酸浓度的确定⽅法，明确检测限参考品中病毒核酸浓度的确定依据，检测限参考品中呼吸道病毒核酸浓度应为申报产品检测限浓度或略⾼于检测限浓度，检测限参考品应包含申报产品应检出的呼吸道病毒所有亚型。
5.3精密度参考品
可不包含所有涉及的呼吸道病毒⾎清型，但应选择多个临床较常见的型别，针对所选型别应⾄少包含3个⽔平：阴性⽔平、临界阳性⽔平、（中或强）阳性⽔平。
（三）主要⽣产⼯艺及反应体系的研究资料
1.介绍产品主要⽣产⼯艺，可以图表⽅式表⽰，并说明主要⽣产⼯艺的确定依据。
2.反应原理介绍。
3.详述样本采集、样本处理⽅式的选择和设置，提供相关的研究资料。
4.确定最佳反应体系的研究资料，包括样本⽤量、各种
酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离⼦浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。
5.不同适⽤机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。
6.如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进⾏⼯艺优化的研究资料。
（四）分析性能评估资料
申请⼈应提交⽣产者在产品研制阶段对试剂盒进⾏的所有性能评价的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究⽬的、试验⽅法、可接受标准、试验数据、统计⽅法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点、适⽤仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。
针对不同的样本类型，申请⼈应分别完成性能评估，包括阴阳性符合率、最低检测限、精密度、分析特异性等。
分析性能评价的试验⽅法可以参考国际或国内有关体外诊断试剂性能评估的指导原则进⾏。对于此类产品，性能评估中所⽤样品（除⾮特别说明）可参考上述企业参考品的制备要求。各项性能评价应符合以下要求。
1.核酸分离/纯化性能
在进⾏靶核酸检测前，应有适当的核酸分离/纯化步骤。该步骤的⽬的除最⼤量分离出⽬的核酸外，还应有相应的纯化作⽤，尽可能去除PCR抑制物。⽆论检测试剂是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应结合检测试剂的特性，对配合使⽤的核酸分离/纯化试剂的提取效率、提取核酸纯度等做充
分的验证，提供详细的验证资料。
2.阳性/阴性参考品符合率
阳性参考品的检测旨在验证试剂盒检测范围内的各呼吸道病毒⾎清型、亚型均可以在适当的浓度被检测到，阳性参考品检测结果应为阳性。阴性参考品旨在评价试剂特异性，阴性参考品检测结果应为阴性。
3.最低检出限
申报产品最低检测限的性能评估资料应包含最低检测限的确定及验证过程。
3.1应针对申报产品所能检出的常见呼吸道病毒⾎清型、基因型分别进⾏确定，建议采⽤培养后病毒原液、以混合阴性样本基质作为稀释液进⾏梯度稀释，难以培养的病毒也可采⽤假病毒或其他适宜⽅法进⾏最低检出限的确定。配制系列稀释的样品进⾏最低检测限的评价，每个稀释度上重复制备3～5份样本，
系列稀释度应能够覆盖⼤部分检出概率区间（0～100%），可通过概率计算或其他适当⽅法进⾏测算选取适当检出率⽔平的浓度作为最低检测限确定的标准，如90-95%（n≥20）的阳性检出率⽔平。病毒原液浓度测定建议采⽤空斑试验，浓度⽔平采⽤空斑形成单位（PFU）为计量单位（最低检出限建议病毒见表1）。
3.2申报试剂应在最低检出限或接近最低检出限的病毒浓度进⾏验证，总测试数不少于20次。
企业应能够提供⽤于最低检出限/定量限验证的病毒株
的来源、型别确认及滴度确认试验等信息。
4.准确性验证
建议申请⼈在病毒LoD⽔平上或附近对声称样本进⾏分析，证明试验能够检测代表时间和地理多样性的其他临床相关病毒株（推荐病毒亚型见表1）。
其中，申报试剂应在最低检测限或接近最低检测限的病毒浓度对每种常见待测流感病毒亚型具有时间和区域多样性的⾄少3个病毒株进⾏验证。
表1 推荐⽤于最低检出限和准确度实验的病毒亚型
5.⼲扰试验（分析特异性）
在本项试验中，申请⼈应充分评估整个系统即从核酸提取到扩增的全过程的分析特异性。⽤于分析特异性的样本应使⽤声称的样本类型基质，并包括每种样本类型。
5.1内源/外源物质⼲扰
应根据所采集样本类型，针对可能存在的⼲扰情况进⾏
验证。建议申请⼈在每种⼲扰物质的潜在最⼤浓度（“最差条件”）条件下进⾏评价，并针对有代表性的呼吸道病毒基因型，⾄少在病毒临界阳性⽔平进⾏⼲扰试验验证。检测的潜在⼲扰物包括样本中的原有物质（如⾎液、⿐腔分泌物或粘膜，及⽤于缓
解淤⾎、⿐噪、刺激或哮喘和过敏症状的⿐腔和咽喉药物）及在样本采集和制备期间引⼊的物质（推荐⽤于⼲扰性试验的物质见表2）。由于体外试验不⼀定能完全反映药物影响，在适⽤情况下可考虑替代性试验如评估临床实验中所纳⼊患者的⽤药影响，因此申请⼈也应评估其他常规或⾮处⽅药物及其代谢物。
表2 推荐⽤于⼲扰试验的物质
5.2竞争性⼲扰
申请⼈应充分考虑临床上常见的呼吸道病毒混合感染情况下（如甲型流感病毒与呼吸道合胞病毒），⾼浓度分析对低浓度分析物检测的影响。建议申请⼈使⽤⼀种最低检测
限浓度的分析物和⼀种⾼浓度分析物评估竞争性⼲扰，竞争性感染的病毒组合建议为同⼀反应体系内病毒、常见重症感染病毒及常见混合感染病毒（如IFV A和HRV、IFV B和HRV、IFV A和PIV、EV和HRV、PIV和HRV等）。竞争性⼲扰试验可与最低检测限、重复性或其他⼲扰试验同时进⾏。
6.交叉反应
6.1与试剂盒中其他病毒的交叉反应性
建议申请⼈充分验证试剂盒中可检测病毒及亚型之间的交叉反应性，应使⽤病毒最⾼临床⽔平浓度进⾏。
6.2与不在试剂盒检测范围中的病原体的交叉反应性
申请⼈应针对可能出现在检测样本中的病原体（如采样部位常见微⽣物、其他呼吸道感染病原体等）进⾏交叉反应验证。⽤于交叉反应验证的样品，应尽量采⽤灭活病原体培养物或临床样本。建议在病毒和细菌感染的医学相关⽔平进⾏交叉反应的验证，申请⼈应详细说明交叉反应样本来源、病原体鉴定和滴度确定的⽅法和结果。病原体种类主要考虑以下⼏⽅⾯：试剂盒检测范围以外的其他呼吸道病原体、感染⼈呼吸道样本中的其他微⽣物（如EBV和MV）、样本中可能出现的其他病原体。
表3 推荐⽤于交叉反应的病原体
7.精密度
企业应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。模拟样本并不能体现临床样本可能带来的所有变异因素，因此精密度评价中应同时包含若⼲临床样本，且精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。
（1）对可能影响检测精密度的主要变量进⾏验证，除检测试剂（包括核酸分离/纯化组分）本⾝的影响外，还应对分析仪、操作者、地点、检测轮次等要素进⾏相关的验证。
（2）设定合理的精密度评价周期，例如：为期⾄少20天的检测，每天⾄少由2⼈完成不少于2次的完整检测，从⽽对批内/批间、⽇内/⽇间以及不同操作者之间的精密度进⾏综合评价。
设定合理的精密度评价周期：包括3个以上地点，每个地点使⽤多名操作员；每天⾄少检测2次、每次重复2次；检测⾄少3－5个⾮连续⽇，以涵盖待检病毒⽇间变异，从⽽对批内/批间、⽇内/⽇间以及不同操作者之间的精密度进⾏综合评价。
（3）⽤于精密度评价的⼈⼯模拟样品和临床样本均应⾄少包含3个⽔平：阴性样品、临界阳性样品、（中或强）阳性样品，并根据产品特性设定适当的精密度要求，临床样本精密度评价中的每⼀次检测均应从核酸提取开始。
①阴性样本：待测物浓度低于最低检测限或为零浓度，阴性检出率应为95%（n≥20）。
核酸检测结果阳性参考值阴性②临界阳性样本：待测物浓度略⾼于试剂盒的最低检测限，阳性检出率应⾼于95%（n≥20）。
③中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且CV≤10%（n≥20）。
（五）阳性判断值确定资料
阳性判断值确定资料主要指对所有声称可检出的病毒亚型核酸检测的Ct值进⾏确认，建议申请⼈对申报
产品⽤于结果判断的临界值予以确认。参考值范围研究资料样本来源应考虑不同年龄、性别、地域等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。如存在判定值灰区，应提供灰区的确认资料。如采⽤其他⽅法对阳性判断值进⾏确认研究，应说明这种⽅法的合理性。
（六）稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适⽤样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请⼈可根据实际需要选择合理的稳定性研究⽅案。稳定性研究资料应包括研究⽅法的确定依据、具体的实施⽅案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供⾄少三批样品在实际储存条件下保存⾄成品有效期后的研究资料。
考虑到病毒RNA极易被降解的特性，企业也应对样本稳定性进⾏研究，主要包括冷藏和冷冻两种条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内，每间隔⼀定的时间段即对储存样本进⾏全性能的分析验证，从⽽确认不同类型样本的效期稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进⾏评价。
对于样本提取后不能⽴即进⾏检测的，应明确核酸储存条件、储存时间等，同时应提供相应的核酸稳定性研究资料。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进⾏详细说明。
（七）临床试验
临床试验的开展、⽅案的制定以及报告的撰写等均应符合相关法规及《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家⾷品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求。临床试验应能检出所有声称可检出的呼吸道病毒及亚型，且每种病毒及常见亚型阳性样本量应具有统计学意义。
1.病例选择及样本类型
申请⼈应选择体征/症状符合呼吸道感染的⽬标⼈，执⾏前瞻性临床试验。申请⼈在建⽴病例纳⼊标准时，应考虑到各年龄段⼈的差异，尽量覆盖各个年龄段⼈。在进⾏结果统计分析时，除总体病例数的要求外，建议对各年龄段⼈分层进⾏数据统计分析（如<5、6－21、22－59和>60岁），总体病例数应符合统计学要求。临床试验⼊组病例应
与产品预期⽤途中适⽤⼈⼀致。临床试验应⾸选新鲜样本，且每种病毒亚型⾄少应有前瞻性阳性样本检出。某些呼吸道病毒亚型在⼈中具有低流⾏率，可⽤已知含特定病毒型或亚型的样本（即留存样本）和模拟样本进⾏补充。如果选择留存样本，则应证明冻存或其他保存⽅法的样本稳定性，且应对样本设盲，以免检测偏差。模拟样本应明确病毒及亚型的鉴定⽅法、鉴定结果。
2.参⽐⽅法
申请⼈应选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为参⽐试剂，采⽤拟申报产品（以下称考核试剂）与之进⾏对⽐试验研究，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。
如⽆已上市产品可选⽤病毒分离培养鉴定或测序⽅法进⾏⽐对，病毒培养应选择新鲜样本。对于难以培养的呼吸道病毒（如⼈偏肺病毒）也可直接采⽤测序⽅法作为参⽐⽅法。
2.1测序试验中的核酸扩增⽅法所测靶序列应与申报产品所测测靶序列不同，且申请⼈应对该靶序列/引物提供⽂献或实验室数据⽀持。申请⼈应在临床研究报告中对选⽤的测序⽅法做详细介绍，并提供以下关于测序试验的详细信息及资料：
（1）测序⽅法原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品
的相关信息。
（2）测序⽅法所⽤引物相关信息，如基因区段选择、分⼦量、纯度、功能性试验等资料。
（3）对所选测序⽅法的分析性能进⾏合理验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序⽅法与拟申报产品的相关性能进⾏适当⽐对分析。
（4）测序⽅法应建⽴合理的阳性质控品和阴性质控品对临床样本的检测结果进⾏质量控制。
（5）提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。
2.2病毒培养时，除细胞病变效应（CPE）外，申请⼈还应进⾏病毒鉴定如病毒特异性抗体染⾊或PCR扩增后测序。单纯的CPE⽆法提供准确的病毒鉴别。申请⼈应提供病毒分离培养的详细实验室流程，以及特定细胞系可作为分离某种病毒的⽂献或数据⽀持。冻融样本可能导致病毒丧失感染⼒，因此不推荐使⽤冻存样本进⾏病毒培养。
3.另外，申请⼈还应根据病毒流⾏情况选择每种病毒亚型核酸检测阳性的新鲜采集样本，使⽤考核试剂与呼吸道病毒感染检测的“⾦标准”⽅法—病毒分离培养鉴定⽅法或其他证明呼吸道病毒感染的⽅法进⾏⽐较研究。如医院⽆病毒培养条件，可由该医院委托其他具有相应条件的机构进⾏。
4.统计学分析
对临床试验结果的统计应选择合适的统计⽅法，如检测结果⼀致性分析、阴性/阳性符合率等。对于本类产品对⽐实
验的等效性研究，常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进⾏四格表卡⽅或kappa检验以验证两

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