甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂比较
范行良1 李长贵1高荣宝2邱平1邵铭1秦成峰3王军志1
1.中国药品生物制品检定所
2. 国家疾病预防控制中心病毒病研究所
3.军事医学科学院微生物流行病研究所
目的为应对甲型H1N1流感突发疫情，筛选适宜的甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒。方法制备评价性参考品盲样并对甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂进行评价。参考品由阳性参考品、阴性参考品和最低检出限参考品组成。通过对33种甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盲样检测结果进行盲评，筛选出入围产品；然后对入围的参评试剂进行统一测评，对检测试剂性能进行确认。结果筛选出7种试定量荧光PCR试剂和1种基因芯片试剂。结论定量荧光PCR方法灵敏度高、特异性好，结果可靠。
关键词甲型H1N1流感病毒核酸检测
Comparison of Influenza H1N1 virus Nucleic Acid Detection Kits
Fan Xingliang1, Li Changgui1, Gao Rongbao2, Qiu Ping1, Shao Ming1,
Qin Chengfeng3, Wang Junzhi 1
1. National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,
2. Institue for Viral Disease Control and Prevention, China CDC
3. Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Medical 【Abstract】OBJECTIVE To find out the appropriate detection methods for influenza H1N1virus, the detection ability evaluation was made. METHOD Three strains of Influenza H1N1virus and seven kinds other virus were prepared and validated. The evaluation Panel was established, in which the positive samples, negative samples and Lowest Detection Level samples were prepared. The evaluation of 33 kinds nucleic acid detection kits was made by manufactures and three national laboratories individually.  All the samples were random and double-blind. RESULT Eight kits including seven real-time PCR kits and one gene chip kit showed relative high specificity and sensitivity. CONCLUSION The real-time PCR method is available for scanning the influenza H1N1 virus infection.
【Key words】Influenza H1N1 virus; nucleic acid detection
2009年4月，墨西哥和美国发生人感染甲型H1N1流感病毒疫情，世界卫生组织随后宣布此次疫情为“公
共卫生紧急事件”，将此次流感大流行警告级别逐步提高到5级。为应对突发性甲型H1N1流感疫情，对感染者及时有效地鉴别，是控制疫情发展及指导临床的首要一环。WHO公布了甲型H1N1流感病毒实验室诊断方案，国内各科研机构及相关单位也及时研制出了大量诊断方法和产品。本文对这些产品的实验室检测能力进行了评估。
材料和方法
1. 毒种来源及验证：3株甲型H1N1流感病毒（A/Sichuan/SWL1/09、A/Beijing/SWL5/09、A/California/07/09），季节性H1N1流感病毒、季节性H3N2病毒、H5N1禽流感病毒及乙型流感病毒由中国疾病预防控制中心病毒病研究所提供。呼吸道合胞病毒、腺病毒及3型副流感病毒由中国药品生物制品检定所提供。所有样品均经过定量荧光PCR方法的验证，甲型基金项目：科技部甲型H1N1流感联防控应急科研项目（2009BAKYJ002）.
通讯作者：王军志，E-mail：*****************
H1N1流感病毒均进行了测序。
2. 参评试剂：科技部筛选出的33种诊断试剂，其中荧光PCR 19种，RT-PCR 3种，基因芯片4种，NASBA 2种、LAMP 2种、其他3种。
3. 评价性参考品的制备和组成：
3.1 评价性参考品的组成：阳性参考品由2株甲型H1N1流感病毒（A/Sichuan/SWL1/09、A/California/07/09）组成；最低检出限参考品由1株甲型H1N1流感病毒（A/Beijing/SWL5/09）经10倍倍比稀释后组成；阴性参考品将季节性H1N1流感病毒、季节性H3N2病毒、H5N1禽流感病毒合并为一管，将乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒及3型副流感病毒合并为另一管。另制备2管病毒裂解液作为基质对照。
3.2参考品制备：所有流感病毒均为鸡胚尿囊腔接种，培养天后，离心取上清，经血凝效价测定后，分装冻存。呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒均为Hep－2细胞培养。所有样品均加入Qiagen病毒裂解液（WHO推荐）裂解灭活。
3.3最低检出限浓度范围的确定：将甲型H1N1流感病毒（A/beijingSWL5/09，64HAU）10倍系列稀释9个梯度到10-9，采用Qiagen公司的QIAamp 病毒RNA提取试剂盒提取核酸，进行荧光PCR检测，根据结果确定最低检出限浓度范围。
4. 样品编盲：所有样品进行编盲，所有编号均为唯一标识，随机编组。
5. 多实验室协同检测：每个产品由2个实验室平行检测，根据结果确定入围试剂的排序。
结果
1. 病毒毒种的验证：
用WHO推荐的甲型H1N1流感病毒特异性探针引物扩增3份阳性样品，结果均有扩增曲线，表明均为甲型H1N1流感病毒。（见图1）
图1甲型H1N1流感病毒样品验证
Figure 1 Validation of Influenza H1N1 virus
1.A/beijingSWL5/09；3.A/california07/09；A/sichuansuli/09
用甲型通用型引物探针扩增甲型流感病毒，结果均有扩增曲线，
图2  甲型流感病毒通用引物（M基因）荧光PCR扩增结果
Figure 2 FR-PCR result of Influenza virus type A by universal primers(M gene)
阳性对照
图3甲型H1N1流感病毒荧光PCR扩增结果
Figure 3 FR-PCR result of Influenza H1N1 virus
非甲型H1N1流感病毒（包括2株季节性甲型H1N1，2株季节性甲型H3N2，1株人禽流感病毒H5N1）均没有特异性扩增，说明季节性甲型流感病毒阴性参考品中没有污染甲型H1N1流感病毒。
2. 最低检出限参考品稀释倍数的确定
将甲型H1N1流感病毒10-5到10-8五个稀释度进行定量荧光PCR复孔检测，结果表明样品随稀释倍数的增加，CT值相应梯次增加，符合10倍倍比稀释特点。（见图4）
图4 最低检出限样品扩增结果
Figure4 FR-PCR result of Low Detection Level samples
3. 盲样比对结果：
经过盲样比对，33种参评试剂对2份阳性样品的检出率分别达到了96.97%和
93.94%，说明参评试剂对于甲型H1N1流感病毒（无论国内株还是国外株）均能很好地
检出；对于特异性样品，各试剂表现出一定的差异，7种试剂发生了非特异扩增；对于灵敏度样品，各试剂反应出明显的不同，16种试剂在10-5稀释度已经不能检出，随着稀释倍数的增加检出的比例明显下降，至10-9稀释度，所有试剂均不能检出。（见图5）
5101520253035阴性
1
阴性
2
阴性
3
阴性
4
阴性
5
阳性
核酸检测结果阳性参考值阴性
1
阳性
21/1000001/10000001/1000000001/100000
0001/1000000000
样品名称
试剂盒数
图5 甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盲样结果比较
Figure 5 Comparison of Influenza H1N1 nucleic acid detection kits
在本次比对中，通过对不同方法检测结果的分析，RT-PCR 、基因芯片及其他方法试剂的阴阳性符合率较好，所有参评试剂均未出现假阳性和假阴性结果。19种定量荧光检测试剂的阳性符合率在50％～100％之间，阴性参考品符合率为40％～100％。这些试剂均能将季节性甲型流感病毒与甲型H1N1流感
病毒区分，未发生假阳性反应；但有3种试剂与其他病毒发生了交叉反应；另分别有2种和3种试剂分别对2份阴性对照了产生了非特异扩增；1种试剂未能检出所有阳性样品。NASBA 方法试剂对阴性对照样品和其他病毒的检测结果均为阴性，但有一种试剂季节性H1N1流感病毒检测结果为阳性；另一种产品2份阳性样品均未检出。2种LAMP 检测试剂对阳性样品均能检出，但对阴性样品分别出现非特异反应，阴性符合率均为60％。（见表1）
表1 不同方法检测阴阳性样品结果比较
T able 1 Specificity Comparison of Influenza H1N1 nucleic acid detection kits
阴性对照1
阴性对照2
其他病毒
其他甲型流感病毒
季节性甲型流感病毒
甲型H1N1
1
甲型H1N1
2
试剂总数
定量荧光PCR 17（89.5%） 16（84.2%） 16（84.2%）19（100％）18（94.7%）19（100％） 18（94.7%）19RT －PCR 3（100％） 3（100％） 3（100％）3（100％）3（100％）3（100％） 3（100％）3LAMP 2（100％） 1（50%） 1（50%）
1（50%）
1（50%）2（100％） 2（100％）2NASBA 2（100％） 2（100％）
2（100％）2（100％）1（50%）1（50%） 1（50%）2基因芯片 4（100％） 4（100％） 4（100％）4（100％）4（100％）4（100％） 4（100％）4其他
3（100％） 3（100％）
3（100％）3（100％）
3（100％）
3（100％）
3（100％）
3
注：表中数字代表检测结果正确的试剂数目，括弧内为同类试剂检测结果正确比率。
Note: The kits’ number with correct result is in the form. The correct ratio is in the brackets.
不同参评试剂对最低检出限样品检出结果差异较大。3种RT-PCR 产品中只有1种将10-5
稀释度的样品判为可疑，其余稀释度均未检出。LAMP 及其他方法仅检测出至10-5释度。2种NASBA 的检测结果均有跳孔的情况出现。定量荧光PCR 试剂最低检出限结果出现明显分化：近半数定量荧光PCR 试剂仅能检测出10-6稀释度样品，随着稀释度的增加，能够检
出的试剂数目逐步减少，至10-9稀释度所有定量荧光PCR试剂均不能检出。基因芯片产品总体灵敏度低
于定量荧光PCR，仅1种试剂的灵敏度可以达到10-7，见表2。
表2不同检测最低检出限结果比较
T able 1 Lowest Detection Level（LDL）Comparison of Influenza H1N1 nucleic
acid detection kits
最低检出限
总数
10-510-610-710-810-9
定量荧光PCR 111186019
RT－PCR 10000  3
LAMP 10200  2
NASBA 11100  2
基因芯片21100  4
其他10000  3
注：表中数字代表检测结果正确的试剂数目，括弧内为同类试剂检测结果正确比率。Note: The kits’ number with correct result is in the form. The correct ratio is in the brackets.
4. 统一测评：
在盲样比对的基础上，对筛选出的8种诊断试剂进行了多实验室平行评价。结果表明，8种试剂阴阳性符合率与盲样检测结果基本相符，试剂间的差异仍主要表现为最低检出限在10-7～10-8稀释度8次重复实验检出率的差异。根据实验结果对8种试剂进行了排序。
结论
本次评价是为应对甲型H1N1流感突发疫情，筛选疫情监控手段而进行的。整个评价分为盲样初筛和统一评价二步。盲样初筛是为了让试剂尽量接近研发时（即最佳的人员、设备、设施）的状态下进行。通过发放盲样和结果盲评的方法来保证结果的可靠性。统一评价是为了使试剂在统一条件下多实验室平行检测，通过第三方实验最终确认排序结果。
本研究首先建立了甲型H1N1流感病毒核酸评价性参考品。评价性参考品由阳性参考品、阴性参考品和最低检出限参考品组成。阳性参考品中既有美国标准毒株，也有中国分离株。考虑到地域的差异，中国分离株中又包括了南方分离株和北方分离株。因此通过阳性参考品可以对试剂的检测谱进行考察。实验结果表明，33种诊断试剂中绝大多数都可以对甲型H1N1流感病毒很好地检出，只有一种诊断试剂阳性样品均不能检出，另一种诊断试剂仅能检出A/Sichuan/SWL1/09株。阴性参考品包括了三类样品：一类是甲型H1N1流感病毒基因结构类似的病毒，如季节性甲型、季节性乙型流感病毒等；一类是与流感临床症状相似的病毒，如RSV、腺病毒、副流感病毒等；另一类为纯阴性样品。结果表明，5种试剂纯阴性样品出现非特异扩增，4种试剂与临床症状相似病毒，1种试剂与季节性甲型（非H1N1），3种试剂与季节性H1N1流感病毒发生了非特异反应。出现非特异扩增可能的原因很多，如实验室污染，仪器性能不稳定、引物探针设计不完善等。按照应急评价原则，防治误诊、漏诊的发生，出现假阴性假阳性结果的试剂均未进入统一测评。为了对试剂的检测灵敏度进行比较，本研究将甲型H1N1流感病毒全病毒培养液灭活后进行了系列稀释，通过预实验选取了10-5～10-9稀释度范围制备盲样。结果表明，33种诊断试剂的灵敏度在此范围内得到了很好的区分，随着稀释倍数的增加可以检出的试剂数目明显下降，至10-9稀释度所有试剂均不能检出。本研究选取了灵敏度高于10-6稀释度的8种试剂进入统一测评。
本次测评对甲型H1N1流感核酸检测试剂的实验室检测性能进行了初步评估，结果表明

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