基于核酸检测方法的金黄葡萄球菌和耐甲氧西林金黄葡萄球菌检测试剂注册技
术审查
指导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对基于核酸检测方法进行耐甲氧西林金黄葡萄球菌和金黄葡萄球菌鉴别检测的体外诊断试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。
本指导原则是针对基于核酸检测方法进行耐甲氧西林金黄葡萄球菌和金黄葡萄球菌鉴别检测的体外诊断试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、适用范围
（一）临床背景
金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）为革兰阳
性球菌，是葡萄球菌属的一种，分布广泛，多种动物和人均有易感性，是临床上常见的致病菌。随着抗菌药物的使用，逐渐出现耐药型金黄葡萄球菌，如耐甲氧西林金黄葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）。MRSA具有多重耐药性，不仅对β-内酰胺类抗菌药物耐药，也对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类和喹诺酮类药物都表现出不同程度的耐药，其对不同抗菌药物的耐药率存在较大的地域差异，并有不同的变化趋势。
MRSA分为医疗机构相关性MRSA （healthcare-associated MRSA，HA-MRSA)、社区相关性MRSA ( community-associated MRSA，CA-MRSA )和家畜相关性（Livestock- associated MRSA，LA-MRSA）。CA-MRSA 和HA-MRSA 、LA-MRSA在微生物学、细菌耐药（如HA-MRSA相较于CA-MRSA表现出更多多重耐药）及临床特点方面（如感染部位）有较大差异，根据这些特点可以将两者进行区分。但由于人员在医院和社区间不断流动，CA-MRSA 和HA-MRSA 的差异日渐缩小。MRSA的分型有多种方式，如SCCmec、spa基因分型、多位点序列分型（MLST）、基于脉冲场凝胶电泳（PFGE）的分型等。
MRSA的耐药机制可能是由于MRSA受到外界刺激后本身固有耐药基因被激活或是引入了外来的耐药基
因并激活。目前临床分离的MRSA菌株对大多数β-内酰胺抗菌药物耐药（新型头孢菌素类除外），大部分耐药是由mecA、mecC 基因介导，但是小部分MRSA不携带mecA基因，存在其它耐药机制。
目前SA的临床检测方法包括：分离培养后，经染观察、血浆凝固酶试验、生化鉴定，质谱鉴定及聚合酶链反应（PCR）检测耐热核酸酶（nuc）基因、SA保守基因16S rRNA 和SA多种毒素基因。
MRSA的检测方法包括头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林微量肉汤/琼脂稀释法（MIC）、苯唑西林琼脂筛选法、青霉素结合蛋白（PBP2a）乳胶凝集法、显培养基法、自动化药敏检测以及聚合酶链反应（PCR）检测mecA等基因方法。
美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐用于MRSA 的检测方法有：纸片扩散法、2%NaCl肉汤/琼脂稀释法和苯唑西林琼脂筛选法，这些检测方法均需要在33-35℃条件下孵育24小时。
目前临床推荐选择头孢西丁筛查试验进行MRSA的检测，还可以选择苯唑西林微量肉汤/琼脂稀释法（MIC）。
MRSA/SA的临床检测样本类型包括但不限于鼻拭子、痰液、皮肤及软组织感染样本、血培养阳性并革兰染法阳性球菌的样品等人体样本和培养物。不同样本类型可能适用于不同的临床预期用途：如用于医疗机构对住院病人包括重症监护病人、手术病人及长期护理病人等MRSA院内感染的预防和控制的监
测，用于结合其他实验室检测如微生物培养等辅助诊断MRSA/SA的感染，用于临床需进行培养检测的患者MRSA/SA感染的辅助诊断等。
（二）本指导原则适用范围
本指导原则适用于基于核酸检测方法进行耐甲氧西林金黄葡萄球菌和金黄葡萄球菌鉴别检测的体外诊断试剂。常见方法包括荧光聚合酶链反应（PCR）方法、基因芯片法等。本指导原则的相关内容基于荧光聚合酶链反应（PCR）方法对产品相关申报资料提出要求，其他方法的相关产品可依据方法学的具体特点参照执行。
二、注册申报资料要求
（一）综述资料
核酸检测结果阳性参考值阴性综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其
他内容，其中，与预期用途相关的临床适应症应重点描述申报产品所检测的金黄葡萄球菌鉴定基因的选择依据、耐药突变位点与耐甲氧西林金黄葡萄球菌的相关性、基因选择的依据及覆盖的耐药菌的情况、产品验证覆盖的耐药菌株及其在我国的流行特征；产品描述应明确申报产品所有可检出的耐药基因
型（可包含不同分型方式下的分型，如SCCmec 型、spa型以及PFGE分型）、尚未验证的耐药菌株型别；同类产品在国内外批准上市的情况，应着重从所检菌株覆盖情况、检测的最低检出限及不同菌株和型别间的交叉反应等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。综述资料的撰写应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。
（二）主要原材料研究资料
此类产品主要为PCR方法，主要原材料包括引物、探针、DNA聚合酶、dNTP、尿嘧啶糖基化酶（如有）、核酸分离/纯化组分（如有）、试剂盒质控品及企业参考品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备及质量标准等的研究资料、质控品的确认试验资料；生产企业还应提供企业参考品的原材料选择、来源、质量指标、参考品的制备及阴阳性的确认过程等。
1.引物和探针：包括申报产品检测靶序列的引物和探针以及内对照的引物和探针。应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。针对检测靶序列的引物和探针，建议设计两套或多套引物、探针以供筛选，针对预期适用的型别进行检出准确性和特异性（如交叉反应）的评价，可采用扩增靶序列与SA和MRSA 基因组比对研究的方法，最终确认最佳组合，并提交筛选的
研究数据。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度检查、浓度检查及功能性实验等。
2.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其质量标准如下：
2.1DNA聚合酶应包括DNA聚合酶活性、无核酸内切酶活性、热启动能力（如适用）、热稳定性等。
2.2如申报产品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，应对其酶活性及热稳定性等质量控制标准进行规定。
3.dNTP：质量标准应至少包括纯度检查及功能性实验等。
4.核酸分离/纯化组分（如有）的原理介绍、主要组成、主要原材料的质量控制标准及相关验证资料。
5.试剂盒质控品
试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒质控品来实现，针对阳性质控品和阴性质控品，申请人应明确质控品的来源、质量标准、质控品阴阳性的确认方法及相关验证资料。质控品应参与样本处理和检测的全过程，如核酸的平行提取等步骤。申报产品的质控体系应考虑以下几个方面：
5.1阳性质控品中应含有包含试剂盒所检靶序列的DNA，优先使用MRSA/SA分离灭活菌株，也可以采用工程菌株、克隆菌株等。企业应对质控品的检测结果做出明确的范围要求（如Ct值）。
5.2阴性质控品应不含试剂盒所检靶序列的基因，阴性质控的基质应与实际样本基质一致或接近，以对可能存在的交叉污染产生的假阳性结果进行质量控制。
5.3对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，申请人应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。对内对照的检测结果亦应做出明确的范围要求（如Ct值）。

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