EB病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请⼈对EB病毒核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是针对EB病毒核酸检测试剂技术审查的⼀般要求，申请⼈应依据产品的具体特性确定其中内容是否适⽤，若不适⽤，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进⾏充实和细化。
本指导原则是对申请⼈和审查⼈员的指导性⽂件，但不包括注册审批所涉及的⾏政事项，亦不作为法规强制执⾏，如果有能够满⾜相关法规要求的其他⽅法，也可以采⽤，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进⾏验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关⼈员应在遵循相关法规的前提下使⽤本指导原则。
本指导原则是在现⾏法规和标准体系以及当前认知⽔平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进⾏调整。
⼀、适⽤范围
EB病毒（Epstein－Barr virus，EBV）为疱疹病毒科，疱疹病毒IV型，是⼀种嗜⼈类淋巴细胞的疱疹病毒。EBV是双链DNA病毒，基因组长约172kb，在病毒颗粒中呈线性分⼦，进⼊受感染细胞后，其DNA发
⽣环化并能⾃我复制。淋巴细胞中潜伏感染的EBV可表达2种不翻译成蛋⽩质的RNA（即EBV-encoded RNAs，EBERs），包括EBER1和
EBER2，6种核抗原（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C和LP），2种潜伏期膜蛋⽩（潜伏膜蛋
⽩，latent membrane protein，LMP），包括LMP1、LMP2A/B。
EBV在⼈中感染⾮常普遍。除原发性EBV感染可致传染性单核细胞增多症外，EBV还引起慢性活动性EBV感染和EBV相关噬⾎细胞性淋巴组织细胞增⽣症等⾮肿瘤性重症EBV相关疾病。EBV还与许多肿瘤的诊疗相关。针对不同的EBV感染相关疾病，选择适当的临床标本和实验室检测⽅法，对于EBV感染相关疾病的诊断和⼗分重要。
本指导原则所述EB病毒核酸检测试剂指基于分⼦⽣物学相关⽅法的核酸检测技术，以EB病毒核酸序列为检测靶标，对来⾃⼈体样本（如全⾎、⾎浆、⾎清等）中的EB病毒进⾏体外定量检测的试剂。结合临床表现和其他实验室指标，本类产品可⽤于EB病毒感染实验室诊断及临床应⽤。
核酸检测结果阳性参考值阴性
本指导原则适⽤于基于实时荧光PCR（Real-time polymerase chain reaction，qPCR）等核酸检测⽅法的EB病毒核酸检测试剂。对于EB病毒定性检测或其他⽅法，可能部分要求不完全适⽤或本⽂所述内容
不够全⾯，申请⼈可以根据产品特性对适⽤部分进⾏评价或补充其他的评价资料进⾏相应性能的验证，但需阐述不适⽤的理由，并说明替代⽅法的科学合理性。
本指导原则适⽤于进⾏产品注册和相关许可事项变更的产品。
⼆、注册申报资料要求
（⼀）综述资料
综述资料主要包括产品预期⽤途、产品描述、有关⽣物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从⽅法学及病原体检出能⼒等⽅⾯写明拟申报产品与⽬前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。对于本类申报产品，应着重从样本类型、样本采集与制备⽅式、⽬标基因⽚段的选择、⽅法学特征等⽅⾯描述。
（⼆）主要原材料的研究资料
此类产品的主要原材料应包括EB病毒检测试剂的所有主要组成成分，如引物、探针、酶、提取成分等。如为申请⼈⾃⾏研制的主要原材料，申请⼈应对EB病毒⽬的基因序列确定、引物和探针选择、酶的选择和验证等实验过程予以详述；并提供对各主要原材料的性能研究资料，如：外观、纯度、蛋⽩浓度、功能性研究等。制备完成的原料成品应进⾏质量检验以确认其符合标准要求，整个⽣产⼯艺应稳定可控。
如为申请⼈外购主要原材料，应详述每⼀原材料外购⽅来源，提交外购⽅出具的原材料性能指标及质量控制资料，并详述申请⼈对外购主要原材料的各指标质量要求以及确定该原材料作为本产品主要原材料的详细依据。
1.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。
1.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。
2.PCR组分的主要原料（包括引物、探针、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：
2.1脱氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；应提交对其纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料。
2.2引物
由⼀定数量的dNTP构成的特定序列，通常采⽤DNA合成仪⼈⼯合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜⽅法纯化，并对序列准确性、纯度、稳定性、功能性实验等的验证。如为外购，应提供合成机
构出具的合成产物的质检证明，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）结果或⾼效液相⾊谱法（HPLC）分析图谱。
2.3探针
特定的带有⽰踪物（标记物）的已知核酸⽚段（寡聚核苷酸⽚段），能与互补核酸序列退⽕杂交，⽤于特定核酸序列的探测。合成后经PAGE或其他适宜⽅法纯化，在5'-端（和/或3'-端）进⾏标记，并经HPLC或其他适宜⽅法纯化，纯度应达到HPLC纯。应提供合成机构出具的合成产物质检证明，如HPLC分析图谱，应对探针的分⼦量、纯度及标记的荧光基团进⾏核实，并进⾏功能性试验验证。
2.4酶
DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，⽆核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94℃保温1⼩时后仍保持50%活性。尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有⽔解尿嘧啶糖苷键的活性，⽆核酸外切酶及核酸内切酶活性。逆转录酶，具逆转录酶活性，⽆核酸内切酶活性。应对酶活性进⾏合理验证。
3.核酸类检测试剂的包装材料和耗材应⽆脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。
4.企业内部参考品：
企业内部参考品是保证产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之⼀。参考品研究应包括原料选择、制备过程、定值研究、评价指标、统计学分析等。建议采⽤灭活病毒的临床样本或细胞培养后的病毒株建⽴参考品，并溯源⾄国际参考物质/国家参考品（如有），不宜使⽤质粒。内标设置应合理，阴/阳性质控品宜采⽤混合临床样本或病毒株或假病毒制备。试剂盒中包含的定量标准品可采⽤临床样本或病毒株、假病毒或质粒等制备。
内对照（内标）以对管内抑制可能造成的假阴性结果进⾏质控。申请⼈应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证，保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线，不应对⽬的基因的检测造成竞争性抑制⽽导致假阴性，对内标的Ct应有明确的范围要求。
阴/阳性质控品应参与样本核酸的平⾏提取，以对整个PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进⾏合理质量控制。企业应对各种质控品的Ct做出明确的范围要求。
企业应提交详细的溯源性研究资料。企业制备的企业内部参考品、商品化校准品均应能够溯源⾄国际参考物质/国家参考品（如有）。
（三）主要⽣产⼯艺及反应体系的研究资料
基本⽣产⼯艺主要包括：配制⼯作液、半成品检定、分装和包装。配制⼯作液的各种原材料及其配⽐应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH等关键参数进⾏有效控制。
⽣产⼯艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本⽤量、试剂⽤量、反应条件、校准⽅法、质控⽅法、稳定性和有效期，提供确切的依据，主要包括以下内容：
1.主要⽣产⼯艺介绍，可以图表⽅式表⽰。
2.DNA提取纯化⽅法优化，建议包含纯化步骤，内标、质控品均应全程参与提取纯化。
3.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离⼦浓度、样本量、加样量及反应体积等。
4.确定PCR各阶段温度、时间及循环数的研究资料。
5.对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。
6.不同适⽤机型的反应条件的对⽐分析，如果有差异应分别详述。
（四）分析性能研究资料
申请⼈应提交⽣产者在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进⾏的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究⽬的、实验设计、研究⽅法、可接受标准、实验数据、统计⽅法等详细
资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适⽤仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。分析性能评价的实验⽅法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）⽂件或国内有关体外诊断产品性能评估的指导原则进⾏，建议着重对以下分析性能进⾏研究。
1.EB DNA提取
病毒DNA提取主要有以下⽬的：富集⽬的基因浓度、保证⽬的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均⼀性、去除PCR抑制物，是决定PCR成败的关键环节。因此，⽆论申报产品是否含有DNA分离/纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做详细的验证。临床标本中可能含有各式各样的PCR抑制物，因此，对于DNA提取试剂的选择，除最⼤量分离出⽬的DNA外，还应有纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。⽬前常见的DNA分离纯化⽅法和改良⽅法各有优势和不⾜，申请⼈应结合申报产品的特性，合理选择DNA分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料（提取效率、与后续试验的配合等）。
2.最低检出限与定量限（分析灵敏度）
（1）最低检出限与定量限的确定
建议使⽤国际参考物质/国家参考品（如有）进⾏梯度稀释并多次检测，并建议采⽤95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。
定量限应⾼于或等于检出限，将多次（⾄少20次）测量的结果符合试剂准确度要求的最低病毒⽔平作为定量限。
（2）最低检出限和定量限的验证
申报试剂应在最低检出限或接近最低检出限、定量限的病毒浓度进⾏验证。
企业应能够提供⽤于最低检出限/定量限验证的病毒株的来源、及浓度确认试验等信息。不同样本类型（如涉及），应分别评价最低检出限及定量限。
3.线性范围
线性范围确定的研究应使⽤⾼值临床样本或病毒株按⼀定浓度加⼊⾎液基质中（由可溯源⾄国际参考物质/国家参考品（如有）的⽅法定量）进⾏梯度稀释，稀释液应使⽤经确认为阴性的混合⼈⾎液样本，应包含不少于9个浓度（应包含接近最低检测限的临界值浓度），使⽤⾄少3个批次的试剂进⾏试验。通过评价⼀定范围内的线性关系及各⽔平的准确度确定该产品的线性范围。不同样本类型（如涉及），应分别评价线性范围。
4.准确度
应使⽤国际参考物质/国家参考品（如有）或企业内部参考品和临床样本进⾏阳性/阴性符合率或者⽅法学⽐对研究。
5.精密度
5.精密度
应对可能影响检测精密度的主要变量进⾏验证，评估重复性和重现性，包括运⾏内的变异和运⾏间、⽇内、⽇间、批次间、操作者间、仪器间和地点间的变异。
建议设定合理的精密度评价周期，例如为期12天的检测，每天由2⼈完成不少于2次的完整检测，注意应包括核酸分离/纯化步骤。可采⽤临床样本进⾏试验，⾄少包含3个浓度⽔平：阴性样本、略⾼于最低检测限的弱阳性样本、中等阳性样本。
6.特异性
（1）交叉反应
①⽤于EB DNA检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下⼏⽅⾯可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状（推荐种类见表1）。
②建议在病毒和细菌感染的医学相关⽔平进⾏交叉反应的验证。通常，细菌感染的⽔平为106 cfu/mL或更⾼，病毒为105 pfu/mL或更⾼。
③申请⼈应提供所有⽤于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。有关交叉反应验证的信息应以列表的⽅式在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。
表1 ⽤于交叉反应研究的微⽣物（推荐）
（2）⼲扰物质
应针对不同样本类型，分别评价可能存在的⼲扰情况。建议在每种⼲扰物质的潜在最⼤浓度（“最差条件”）进⾏评价，并在待测物的医学决定⽔平进⾏检测。潜在的⼲扰物质包括内源性、外源性和其他已报道的⼲扰物质。
样本应⾄少选取全⾎（或⾎红蛋⽩和⽩细胞）、⼈⽩蛋⽩、胆红素、⽢油三酯、⾃⾝抗体等进⾏验证，并注明对被测物不产⽣⼲扰的最⾼限值。
7.其他需注意问题
对于适⽤多个机型的产品，应提供如产品说明书【适⽤机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。如适⽤于不同样本类型，应提交对不同样本类型⼀致性的验证，包括不同抗凝剂、采⾎管（如涉及）的验证。
（五）阳性判断值研究资料
申请⼈应考虑不同地理区域流⾏病学背景以及⼈⼝统计学特征（包括性别、地域、种族等因素）的差异，选择具有代表性的样本建⽴阳性判断值，注意应纳⼊⼀定数量的弱阳性样本。如采⽤其他研究⽅法，应说明其合理性。
对于荧光实时PCR⽅法即为⽤于结果判读的Ct值和/或核酸浓度的确定资料，包括确定基线阈值（threshold）、阈值循环数（Ct）、核酸浓度（如适⽤）的研究资料等。
另外，建议申请⼈考虑建⽴阳性判断值时使⽤的受试者样本对于⽬标⼈的代表性，通过临床评价进⼀步验证和确认阳性判断值的准确性。
（六）稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适⽤样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请⼈可根据实际需要选择合理的稳定性研究⽅案。稳定性研究资料应包括研究⽅法的确定依据、具体的实施⽅案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供⾄少三批样品在实际储存条件下保存⾄成品有效期后的研究资料。
应对样本稳定性进⾏研究，主要包括冷藏和冷冻等条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔⼀定的时间段即对储存样本进⾏主要性能的分析验证，从⽽确认不同类型样本的效期稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进⾏评价。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进⾏详细说明。
（七）临床评价资料
临床试验的开展、⽅案的制定以及报告的撰写等均应符合相关法规及《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家⾷品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求。
1.试验⽅法
对于EB病毒核酸检测试剂⽽⾔，临床试验可采⽤试验⽤体外诊断试剂与临床普遍认为质量较好的已上市同类产品进⾏⽐较研究试验，证明两者具有等效性，从⽽间接证明试验⽤体外诊断试剂临床性能能够满⾜预期⽤途的要求。对⽐试剂在预期⽤途、适⽤⼈、样本类型、检测性能等⽅⾯应与试验⽤体外诊断试剂具有较好的可⽐性。
对于⽐较研究试验中测定结果不符的样本，应采⽤临床检验实验室已建⽴的参考⽅法或者其他合理的⽅法（如第三⽅试剂、核酸序列测定⽅法等）进⾏复核。
2.试验机构
应考虑拟申报产品的特点和预期⽤途，结合流⾏病学背景，选择具有⼀定地域代表性的试验机构和受试者。原则上应具有分⼦⽣物学⽅法检测以及相关学科的优势，实验操作⼈员有⾜够的时间熟悉检测系统的各环节，熟悉评价⽅案。
3.试验⽅案
临床试验实施前，研究⼈员应设计科学合理的临床研究⽅案。各临床研究机构的⽅案设置应基本⼀致，且保证在整个临

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