新冠实验室检测方案
一、新型冠状病毒的实验室检测
新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光RTPCR鉴定。
任何新型冠状病毒的检测都必须在具备适当条件的实验室由经过相关技术安全培训的人员进行操作。
本指南中的核酸检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsid protein，N）。核酸检测结果阳性参考值阴性
在实验室要确认一个病例为阳性，满足以下条件：
1）同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性实时荧光RTPCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。
2）阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：
样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；
样本收集的过早或过晚；
没有正确的保存、运输和处理样本；
技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。
二、实时荧光RTPCR方法检测新型冠状病毒核酸
（1）目的
规范实时荧光RTPCR方法检测新型冠状病毒核酸的工作程序，保证实验结果的正确可靠。
（2）范围
适用于实时荧光RTPCR方法检测新型冠状病毒核酸。
（3）职责
检测人员：负责按照本检测细则对被检样本进行检测。
复核人员：负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核。
部门负责人：负责对科室综合管理和检测报告的审核。
（4）样本接收和准备
核对被检样本姓名、性别、年龄、编号及检测项目等；
待检样本的状态如有异常，需注明；
待检样本应存放于70摄氏度冰箱保存。
（5）检测项目
1、新型冠状病毒核酸测定（实时荧光RTPCR方法）推荐选用针对新型冠状病毒的ORF1ab、N基因区域的引物和探针。
靶标一（ORF1ab）：
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
荧光探针（P）：5'FAM CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG BHQ13'
靶标二（N）：
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
荧光探针（P）：5'FAM TTGCTGCTGCTTGACAGATT TAMRA3'
核酸提取和实时荧光RTPCR反应体系及反应条件参考相关厂家试剂盒说明。
2、结果判断
阴性：无Ct值或Ct大于等于40。
阳性：Ct值小于37，可报告为阳性。
灰度区：Ct值在3740之间，建议重复实验，若重做结果Ct值小于40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
注：如果用的是商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。
三、病原生物安全实验活动要求
根据目前掌握的新型冠状病毒的生物学特点、流行病学特征、临床资料等信息，该病原体暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理，具体要求如下：
（1）病毒培养
病毒培养是指病毒的分离、培养、滴定、中和试验、活病毒及其蛋白纯化、病毒冻干以及产生活病毒的重组实验等操作。
上述操作应当在生物安全三级实验室的生物安全柜内进行。
使用病毒培养物提取核酸，裂解剂或灭活剂的加入必须在与病毒培养等同级别的实验室和防护条件下进行，裂解剂或灭活剂加入后可比照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作。
实验室开展相关活动前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。
（2）动物感染实验
动物感染实验是指以活病毒感染动物、感染动物取样、感染性样本处理和检测、感染动物特殊检查、感染动物排泄物处理等实验操作，应当在生物安全三级实验室的生物安全柜内操作。
实验室开展相关活动前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。
（3）未经培养的感染性材料的操作
未经培养的感染性材料的操作是指未经培养的感染性材料在采用可靠的方法灭活前进行的病毒抗原检测、血清学检测、核酸提取、生化分析，以及临床样本的灭活等操作，应当在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护。
（4）灭活材料的操作
感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的核酸检测、抗原检测、血清学检测、生化分析等操作应当在生物安全二级实验室进行。
分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作，可以在生物安全一级实验室进行。

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