02 新型冠状病毒核酸检测标准操作程序
1 目的
规范PCR方法检测新型冠状病毒核酸的工作程序，保证实验结果的正确可靠。
2 范围
适合于检验科发热门诊。
3 职责
3.1 检验人员负责按照本检测细则对被检样本进行检测；
3.2 复核人员负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核；
3.3 专业组负责人负责对专业组综合管理和检测报告的审核。
4 程序、内容和要求
任何新型冠状病毒的检测都必须在具备适当条件的实验室由经过相关技术安全培训的人员进行操作。本程序中的核酸检测方法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsid protein，N）。
在实验室要确认一个病例为阳性，满足以下条件：同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性PCR检测结果均为阳性。
阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。
4.1 样本采集（推荐鼻/咽拭子）
4.1.1 咽拭子（使用透景样本保存液）
用 2 根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入样本保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖作为样本使用。
4.1.2 鼻拭子（使用透景样本保存液）
将 1 根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一样本保存液的采样管中，尾部弃去，旋紧管盖作为样本使用。
4.1.3 鼻咽拭子样本（未使用透景的保存液）：
在有鼻咽拭子的收集管中加入1ml生理盐水，振荡混匀后将全部液体倒入1.5ml灭菌离心管中作为样本使用。
4.2 标本保存
用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测，能在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。 应设立专库或专柜单独保存标本，标本运送期间应避免反复冻融。
4.3 样本灭活
为了减少感染样本对人和环境的潜在危害，推荐样本检测前进行灭活处理：先56℃干/水浴60 min，静置10 min至室温（避免气溶胶），然后进行处理。
4.4 核酸提取
4.4.1 Smart32核酸提取仪提取程序
4.4.1.1操作前准备
a)将处理好的样本以及试剂添加在96 孔提取板内。
b)运行实验程序前，检查96 孔提取板及磁棒套是否正确放置（注意：放置磁棒套时，将磁棒套顺着卡槽推入到尽头）。
4.4.1.2操作
a)确保仪器的电源线与合规格的电源插座连接好后，打开仪器背面右下的主电源开关。
b)仪器上电开机后，进行自检。如下图所示：
c)待完成自检后系统进入主菜单操作界面。如下图所示：
d)主界面主要包括仪器功能选项及快捷实验运行方式；通过点击所要运行的程序快捷方式的
图标及“程序列表”，可进入实验运行界面或实验程序列表界面。如下图所示：
e)点击 和 按键查看完整程序运行步骤；
f)点击 按键后，实验程序将开始运行。
注意：执行前请务必确认：
            注意：96孔提取板是否正确放置；
            注意：磁棒套是否推入到位；
            注意：仪器门是否关好。
g)在程序运行过程中，当前运行步骤，该行信息变为深；在程序运行过程中，仪器门不能打开。 
h)实验结束后，仪器弹窗实验结束。
i)在主界面左边框主选项中，点击“开门”选项，当听到“嗒”一声时，手动拉开仪器门。
j)仪器的清理：卸载仪器上的试剂、耗材、实验产生的废物。
k)点击进行紫外灯照射消毒。
4.4.1.3 Smart32 核酸提取仪日常维护
a)指导原则：当Smart32 核酸提取仪在标准的实验室环境下最佳的工作条件工作时，仪器不需要定期的维护，但是，应由经过厂商指导的实验室技术人员进行定期的清洁与自测诊断。
b)清洁：定期或维修搬运前应断电并清洁仪器的外表面，以防止任何可能干扰仪器功能的灰尘粒子。用微湿的软布进行Smart32仪器的清洁，用10%的家用漂白剂及去离子水就可以安全地净化仪器。注意，清洁仪器的外表面均需用微湿的软布。注意：在清洗或执行任何本节所提到的维护前，务必关闭Smart32仪器及相关设备的电源；清洁仪器时请小心，确保无液体流入仪器中。
4.4.2 核酸提取或纯化试剂标准操作程序
4.4.2.1 原理
磁珠结合液中含强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，使核酸解离出来；在其存在下，
释放出来的核酸成分可以结合在磁珠上；随后通过磁珠洗涤液1、磁珠洗涤液2的作用下，将蛋白质，无机盐离子和许多有机杂质去除。然后洗脱液将纯净的核酸洗脱下来。
4.4.2.2 标本要求
a)标本类型：血清、血浆、宫颈脱落细胞、咽拭子、鼻咽分泌物等。
b)标本采集：
血清/血浆 — 用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2 毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25ºC）放置 30～60 分钟，血标本可自发完全凝集析出血清，
或直接使用水平离心机，1500 rpm 离心 5 分钟；吸取上层血清，转移至 1.5ml 灭菌离心管。血浆 — 用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2 毫升，注入含 EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10 次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5～10 分钟 后即可分离出血浆，转移至 1.5ml 灭菌离心管。
咽拭子、鼻咽分泌物等标本的处理请参照卫生部发布的针对该检测物的监测方案和检测技术方案。
宫颈脱落细胞标本的采集需医护人员先用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用宫颈刷置于宫颈口，瞬时针旋转4-6周以获取足量的上皮细胞，然后取宫颈刷置于盛有2ML生理盐水的无菌小试管中。
c)标本储存和运输：新鲜血清2～8℃贮存时间不超过12小时；也可保存-20度待测，保存期为15天。标本运送应采用0℃冰壶。并于12小时送达。
d)标本拒收状态：细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。
4.4.2.3 试剂及仪器设备
a)试剂名称：核酸提取或纯化试剂。
b)试剂生产厂家： 中山大学达安基因股份有限公司
c)包装规格：32人份/盒
d)试剂盒组成： 预分装96孔深孔板2块，蛋白酶K 1瓶。
e)贮存条件和有效期：室温保存；有效期12个月。
f)Smart32核酸提取仪。
4.4.2.4 操作
a)试剂准备（在试剂准备区操作），从试剂盒中取出预分装96孔深孔板，颠倒混匀数次后，使用96孔板离心机500rpm离心1分钟，使试剂和磁珠均甩到孔板底部，使用时小心撕去封膜，防止液体溅出。
b)标本制备及加样（在标本制备区操作）。
c)标本处理：将待测样本与阴性质控品、HCV 强阳性质控品、HCV 临界阳性质控品进行同步处理。在96深孔板的第1、7列（A-H排）中按顺序加入200ul的样本、20ul蛋白酶K。使用smart32型核酸提取仪进行核酸提取（操作见smart32核酸提取仪标准操作程序）
d)程序设置（smart32型核酸提取仪程序编辑）
核酸检测结果阳性参考值阴性
步骤
孔位
名称
等待时间min
混合时间min
吸磁次数
混合速度
容积ul
温度状态
温度℃
1
2
磁珠
0
1
3
中
400
关
0
2
1
磁珠结合液
0
15
3
快
750
第一孔
70
3
3
磁珠洗涤液1
0
2
2
快
600
第6孔
50
4
4
磁珠洗涤液2
0
0
1
中
600
第6孔
70
5
6
洗脱液
0
5
3
中
100
第6孔
70
6
3
丢弃磁珠
0
1
0
中
600
关
0
e)程序运行结束后，第6列和第12列中的液体即为核酸溶液，建议立即使用，如需保存请将核酸转移至灭菌的离心管中，置于-20℃。
4.4.2.5 注意事项
a)实验前请仔细阅读本试剂说明书。
b)不同型号的核酸提取仪由于硬件的关系可能需设置不同的提取程序，详细参数可以咨询试剂厂家。
c)标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃。
d)实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。
e)所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部微生物生物医学实验室生物安全通用准则和医疗废物管理条例

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。