禽流感（avian influenza ，AI ）是由正粘病毒科、流感病毒属A 型流感病毒引起的禽类（家禽或野禽，以及部分哺乳动物）传染病
[1]
。禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型
间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。尤其是高致病性禽流感，是OIE 规定的法定报告A 类动物疫病
[2]
。禽流感病毒在流行的过程中不断变异，跨越宿主屏障，
H5N1亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情，给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。H9亚型禽流感病毒并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型禽流感病毒
[3,4]
。
目前国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。以分子生物学技术为基础的荧光PCR 方法已成为病原核酸检测的主要方法，目前市场的禽流感病毒检测手段多以单重RT-PCR 为主，不能区分具体亚型，但在平时疫情检测和实施扑灭措施时对这些病毒亚型进行快速检测和定型非常重要。本研究基于Taq-Man-MGB 荧光RT-PCR 技术建立一种禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法，能够在一次反应中对样本中的病毒进行快速定型，满足准确、快速的检测需求。
1材料与方法
1.1质粒样品
携带禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型HA2靶基因序列片段重组质粒pUC57-AIV-H579，浓度为104copies/μL 。
1.2禽流感病毒核酸样品
禽流感病毒H5亚型核酸样品15份、禽流感病毒H7亚型核酸样品15份、禽流感病毒H9亚型核酸样品15份，
禽流感病毒阴性核酸样本30份，由扬州大学禽流感病毒专业实验室分离、鉴定、保存和提供。
1.3特异性核酸样品
鸡传染性支气管炎（LDT3-A 株）cDNA 全基因组、鸡传染性喉气管炎（LDT3-A 株）cDNA 全基因组、鸡新城疫病毒（La Sota 株cDNA 全基因组）、传染性法氏囊病毒（B87株）cDNA 全基因组、减蛋综合征（AV127株）DNA 全基因组、健康鸡组织全基因组DNA ；由扬州大学制备、保存和提供。
1.4试验试剂
酶反应体系：5×Neoscript RT Premix-UNG （Probe qRT-PCR ）（Cat ：M5134-ZD1），购自珠海宝锐生物科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.3仪器
ABI 7500实时荧光定量PCR 仪系统，美国应用生物系统公司。
1.4引物、探针的设计
本研究通过检索GenBank 上收录的禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型传统毒株和变异毒株的HA2基
因序列，利用DNAS-TAR 软件分析比较各亚型序列中高度保守又具有特异性的区域，应用Oligo 软件设计多对特异性的引物、TaqMan 探针，由通用生物系统（安徽）有限公司合成。
1.5禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法的建立
通过单重荧光RT-PCR 方法对设计的引物探针进行筛选，筛选出可准确扩增相应亚型靶标且不能扩增其他亚型的引探组合，再将单重扩增筛选的引探相互配对，筛选出能够同时检测禽流感病毒H5、H7、H9三个亚型且对Ct 值和扩增效率影响不大的三组引探，采用矩阵法摸索引探浓度，优化反应条件，建立三重实时荧光RT-PCR 方法。
1.6敏感性试验
用无核酸酶水10倍梯度稀释重组质粒pUC57-AIV-H579
禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法的建立
杨楠1，
翟少伦2，许军海3，杨丹芳1，娄亚坤1*（1.郑州中道生物技术有限公司郑州450000；2.广东省农业科学院动物卫生研究所广州510000；
3.石家庄市动物卫生监督所石家庄050000
）
了简便、快速、准确的检测禽流感病毒（avian influenza virus ，AIV ）H5、H7、H9亚型（lumpy skin disease virus ，LSDV ），本研究通过对
核酸检测结果阳性参考值阴性
禽流感病毒HA2基因保守区域的分析，设计、合成特异性引物和探针，结合Taq man-MGB 探针技术，建立禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法。该方法敏感性较高，最低检出限为11copies/μL ；与禽类常见病毒核酸均无交叉反应；不同稀释度的重组质粒的检
测变异系数为0.1%～1.16%。上述结果表明，本研究建立的禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法比传统病毒分离鉴定方法时间更短，具有敏感性强、特异性高的特点，更适用于禽流感病毒H5、
H7、H9亚型快速诊断及流行病学调查
。流感病毒；H5亚型；H7亚型；H9亚型；多重荧光RT-PCR
*通讯作者：娄亚坤（1988—），硕士，主要从事动物疫病诊断技术的开发与应用。Email ：
******************。doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2021.06.070
科研动态
101
中国动物保健2021.06
（104copies/μL ），稀释为103copies/μL 、102copies/μL 、10copies/μL 、1copies/μL ，采用禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法进行检测，用于进行最低检测限研究。每个样品重复检测3次，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检测限；根据试验结果，在估计检测限的浓度附近制备若干梯度浓度样品，每个浓度重复检测20次，将具有95%以上阳性检出率的最低浓度水平作为本检测方法的最低检测限，用Graphpad Prism 软件进行概率Logistic 模型回归分析。同时对不同梯度浓度的重组质粒的Ct 值与浓度的对数进行线性回归分析，计算相关系数（R 2）。
1.7特异性试验
采用禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法对鸡传染性支气管炎（LDT3-A 株）cDNA 全基因组、鸡传染性喉气管炎（LDT3-A 株）cDNA 全基因组、鸡新城疫病毒（La Sota 株cD-NA 全基因组）、传染性法氏囊病毒（B87株）cDNA 全基因组、减蛋综合征（AV127株）DNA 全基因组、健康鸡组织全基因组DNA 进行检测，同时设置阳性重组质粒pUC57-AIV-H579做阳性对照，研究该检测方法的特异性。
2结果
2.1禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法的建立
本研究通过单重和多重荧光RT-PCR 试验对设计的引物、探针进行筛选，优化反应条件。最终确定的禽流感病毒H5亚型引物工作浓度为300nM ，探针工作浓度为150nM ；H7亚型引物工作浓度为400nM ，探针工作浓度为200nM ；H9亚型引物工作浓度为300nM ，探针工作浓度为150nM ；模板添加量为5μL ，反应程序为：50℃/20min ；95℃/3min ；95℃/10s ，54℃/30s ，40个循环，采集荧光信号，荧光通道FAM （H5）/VIC （H7）/ROX （H9）。
确定筛选出最终确定的引探序列如下：H5-F ：5'-TACCARATAYTGTCAATTTATT-3'；H5-R ：5'-GARCACATCCATAAAGATAG-3'；H5-LP ：5'-CTYGCCACTGTTG-3'；
所述探针序列5'端标记的荧光基团为FAM ，探针序列3'端
标记的淬灭基团为MGB 。
H7-F1：5'-AGGCAATGCAAAATAGAATA-3'；H7-R1：5'-GGCNAGAAGTATGAAACATGAT-3'；H7-LP1：5'-AAGTATCACATCTT-3'；
所述探针序列5'端标记的荧光基团为VIC ，探针序列3'端标记的淬灭基团为MGB 。
H9-F2：5'-ATTTATTCKACTGTCGC-3'；H9-R2：5'-CTGCANGAYCCATTNGACAT-3'；H9-P2：5'-AAGGCAGCAAACCC-3'；
所述探针序列5'端标记的荧光基团为ROX ，探针序列3'端标记的淬灭基团为MGB 。
2.2分析敏感性试验
采用禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法对10倍梯度稀释的重组质粒pUC57-AIV-H579（104copies/μL 、103copies/μL 、102copies/μL 、10copies/μL 、1copies/μL ）进行检测，每个样品重复3次，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检测限，结果显示，104copies/μL 、
103copies/μL 、102copies/μL 、科研动态
注：“Unde ”表示未检出信号，“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
H5
26.17+26.18+26.34+H727.18+27.13+27.22+H926.1+25.87+25.61+H5
29.17+30+30.09+H729.8+30.91+31.06+H929.54+30.09+29.26+H5
33.62+33.29+33.59+H733.88+33.73+34.35+表1 估计检测限试验结果10质粒浓度
（copies/μL ）
靶标基因荧光RT-PCR 检测结果10
3
10
2
图1多重荧光RT-PCR 检测结果
102
10copies/μL 的检出率为100%，1copies/μL 未检出，因此以10copies/μL 作为估计检测限（表1，图1）。
以重组质粒不同浓度拷贝数为横坐标，Ct 值为纵坐标，获得线性回归方程。结果显示禽流感病毒H5亚型靶标的线性回归方程为y=-3.302x+36.504，R 2=0.99；禽流感病毒H7亚型靶标的线性回归方程为y=-3.262x+36.517，R 2=0.99；禽流感病毒H9亚型靶标的
线性回归方程为y=-3.389x+36.44，R 2=0.991，梯度稀释的重组质粒与Ct 值线性关系良好（图2）。
在估计检测限10copies/μL 的浓度附近制备15copies/μL 、5copies/μL 、1copies/μL 梯度浓度样品，每个浓度重复检测20次，结果显示15copies/μL 、10copies/μL 的浓度样品的检出率分别为100%、100%；5copies/μL 的检出率约为75%，1copies/μL
的检出率不足10%，因此将10copies/μL 的浓度样品确定为最低检测限（表2）。概率回归分析，在95%的置信区间内3个靶标的分析敏感性为11copies/μL 。（图3）。
2.3特异性试验
采用禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法对鸡传染性支气管炎（LDT3-A 株）cDNA 全基因组、鸡传染性喉气
H5H7H9H5H7H9H5H7H9H5H7H9130.9232.4932.0733.5233.233.06-35.3---231.1432.5232.332.6233.6533.2836.236.0335.94---332.2432.6632.4432.6733.2532.95------432.9232.3832.0732.2533.6733.6936.4437.8437.8837.23-37.54532.2132.7932.5333.2833.8333.636.3936.8637.16---632.1632.8132.2232.0233.633.45------731.
9432.5732.3132.6133.9233.5636.2936.5737.06---832.3832.9232.5632.4233.1733.3235.3935.3635.7137.6738.5738.36932.132.5932.0832.1433.5833.4335.0535.3135.49---1032.3432.932.4232.0833.6333.3635.5134.4934.33--37.431132.3332.8832.3233.0533.2633.1135.0334.834.75---1232.2532.8632.6833.633.8432.8735.5735.0835.78---1332.0232.6932.4433.3933.6433.2935.6435.4735.49---1432.2532.8932.3333.0433.3933.1335.4935.8335.0738.9438.937.611532.3432.9232.2933233.3833.236.2135.4235.44---1631.9932.6732.2632.9233.1933.13------1730.9632.7332.3833.2833.2733.0336.136.2836.22---1832.3432.9432.3233.0933.3332.9236.2435.2535.24---1931.8232.5531.9733.4633.7833.1935.7435.7335.76
---20
31.24
32.67
32.5
33.67
33.38
32.92
---
---
1copies/μL 表2 最低检测限试验结果质粒浓度（copies/μL ）15copies/μL 10copies/μL 5copies/μL 注：“-”表示结果为阴性。
管炎（LDT3-A 株）cDNA 全基因组、鸡新城疫病毒（La Sota 株cD-NA 全基因组）、传染性法氏囊病毒（B87株）cDNA 全基因组、减蛋综合征（AV127株）DNA 全基因组、健康鸡组织全基因组DNA 进行检测，结果显示均为阴性，而重组质粒pUC57-AIV-H579的检测结果为阳性，说明该检测方法的特异性较好，不与其他病毒核酸产
生交叉反应（图4）。
3讨论
在对禽流感的监测和控制环节中，最重要的是要进行快速的诊断，及时划定疫点、疫区，并采取封锁等控制措施，防止疫情的扩散。因此，禽流感疫情现场快速诊断，对于采取果断有效的扑灭
图2三重荧光RT-PCR 标准曲线
103
中国动物保健2021.06
和防控措施十分关键。传统的病毒分离测序法费时、费力；用于分型鉴定单重荧光RT-PCR 每次仅能检测一个亚型，不能做出快速而及时的诊断。因此，建立一种快速、准确的分型鉴别方法对禽流感的防控具有重要意义。
本研究克服现有技术的不足，利用Taq man-MGB 荧光RT-PCR 技术建立可有效区分禽流感病毒H5、H7、H9亚型的多重荧光RT-PCR 检测方法。该方法敏感性较高，最低检出限可达11copies/μL ，重复性良好，与禽类常见病毒核酸之间无交叉反应，且反应快速、操作简单，适合大批量检测，对于禽流感病毒的监控、鉴定具有一定的应用价值。
AIV 基因组有8个独立片段，各自编码功能性蛋白，尤其是HA 基因及其编码蛋白尤为重要，与病毒抗原性、毒力、致病性及感染宿主密切相关，同时该基因也是变异较大的基因，是国内外学者研究较多的基
因[5-8]。秦智峰等[9]基于HA 基因建立的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR 检测方法，灵敏度可达到
500copies ；屈素洁等[10]基于HA 基因建立的禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR 检测方法，检测病毒RNA 的灵敏度可达到10-4copies/μL ；Monne 等[11]基于HA 基因建立禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR 检测方法，检测灵敏度可达50copies/μL 。禽流感病毒亚型众多、易变异，对于新的变异株传统的试剂容易漏检。针对这一难点，本研究比对禽流感病毒传统毒株和变异毒株的HA2基因的保守区域，引探设计中使用简并碱基，靶点覆盖范围广，包含近年新出现的突变株。其中H5亚型参考毒株序列，包含近年来出现的clade 2.2，clade 7.2，clade 2.3.2.1，clade 2.3.4，clade 2.3.4.4，clade 2.3.2.1a ，clade 2.3.2.1c ，clade 2.3.4.4d ，clade 2.3.2.1d 等分支及亚分支[12-15]；H7亚型参考毒株序列包含HPAI 和LPAI H7N9基因序列；H9亚型参考毒株序列包含国内3大分支：A/Chicken/Beijing/1/94（BJ94）或A/Duck /HongKong/Y280/97（Y280）、A/Quail/HongKong/G1/97（G1）、A/Duck/Hong Kong/Y439/97（Y439）以及近几年在中国
鸡中流行病毒株A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）等[6,16]。
本研究建立的禽流感病毒H5、H7、H9亚型的多重荧光RT-PCR 检测方法能够有效鉴别H5、H7、H9亚型，具有敏感性强、特异性高、检测时间短等特点，从而为更好地预防和控制禽流感发生和流行提供重要的技术手段。█
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图3最低检测限概率回归
分析
图4特异性试验结
果
科研动态
104
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实验动物传染性疾病防控体系的建立
车国喜
（山东省医疗器械产品质量检验中心济南250101
）
验动物发生传染性疾病会对科研工作造成很多不良影响，一般情况下，实验动物疾病不采用药物，以防止药物代谢对实验结果造成干扰。因此，做好实验动物传染病的预防工作是重中之重。本文主要从控制实验动物疾病传染源、做好日常健康检测与消毒、加强饲养管理措施等方面就建立实验动物传染性疾病的防控体系进行了阐述，以期可以有效预防实验动物传染病的发生
。
验动物；传染性疾病；防控体系
随着现代医学与生物科学的快速发展，实验用动物的需求数量也在迅速加大，但由于操作管理不规范等原因，近来实验动物生物健康的问题多有发生，其中传染性疾病是实验动物的主要疾病类型，对实验用动物的健康产生很大危害。一旦传染性疾病在实验动物中大规模暴发，会对试验研究工作造成的巨大影响无法以经济损失衡量，其中还包括一些人畜共患的传染病类型，一旦泄露传播也会对人畜造成健康威胁。如何科学的管理预防、实验动物传染病，防止其暴发与传播是现代兽医的首要任务之一。加强实验动物安全健康管理，建立一套完善的实验动物传染性疾病防控体系，不仅是保障试验研究工作得顺利进行，更是对人畜的生命健康负责。
1传染性疾病的危害
实验室动物发生传染性疾病，轻者影响动物的健康状态，改变其免疫系统的发育与功能，会对试验研究的结果造成干扰，致使不能得出准确可靠的科研结果。一些严重性的传染病一旦暴发则可能造成试验动物大规模的死亡，影响科研进度，常见的有兔瘟和犬细小病毒等传染性疾病。还有一些人畜共患性传染病，试验动物感染后会严重威胁科研工作者的生命健康，如狂犬病、结核病、禽流感、布氏菌病、沙门氏菌病、大肠杆菌病等。
2实验动物传染性疾病的预防
2.1控制动物来源
控制好传染源是预防传染病发生的三个条件之一。目前大多数实验动物是从生物公司商购，由于各厂家动物品质优劣不一，有些卫生环境不达标的动物很可能会带有传染病源，其次在购买运输过程中也可能发生感染，因此在购买、运输时要遵守生物安全规范，购买合格实验动物。首先严禁从农村等地购买散养动物用以实验，这些动物来源不明确，品系与遗传背景不清楚，还可能携带多种疾病。其次，对于正规程序购买的动物应进行分批、按品种接收和隔离，以便当有疫情发生时可以在小范围、可控制的情况下及时扑杀遏止，防止疾病在实验动物中大规模传播。隔离地点应选择安全性能有保障、不易发生病原体传播扩散、消毒清洁方便的饲舍。灵长类动物可能带有结核病和一些寄生虫病，但自身无明显症状表现，隔离期应在90d 以上。犬、猫的隔离期应超过多数传染病的潜伏期，一般在3～4周。实验用鼠、兔等隔离期一般在3～10d ，不同的品种隔离检疫期不同。发现有人畜共患的烈性传染病（如流行性出血热）等疾病时，这些感染动物应立即扑杀，对隔离区内的饲舍、饲槽、水槽、饲料等进行严格的消毒处理，严禁运出，防止疫情进一步向外扩散。
2.2动物的日常健康监护
实验动物的健康状况应有专门的值班兽医负责每日监护，包括巡视动物房、对动物的个体以及行为进行观察、观察动物的饮水和采食情况、对传染性疾病进行预防、处理排泄物、患病动物以及环境卫生的监督和动物房检测设备的检查。
1）对动物的外貌、精神状况进行观察。观察动物是否患有精神沉郁、食欲不振、皮肤与天然孔的状态是否正常。观察动物排泄的粪便颜、状态、含水量、气味等。
2）检查动物的个体情况。触摸动物的背部、四肢、皮肤、肌肉等
基金项目：山东省医疗器械产品质量检验中心内部项目
（ZX202018）
作者简介：车国喜（1984.12—），女，基础兽医学硕士，兽医师。
doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2021.06.071
105

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