试验研究ＬＩＶＥＳＴＯＣＫＡＮＤＰＯＵＬＴＲＹＩＮＤＵＳＴＲＹＮｏ．４，２０２１
基金项目：达州市哲学社会科学研究“十三五”规划２０２０年度课题———“乡村振兴背景下达州市肉牛产业发展研究”（１０４）
达州县级兽医实验室检测能力比对结果分析
赵小波１，刘俐君１通信作者
，李　成１，杨　青１，黎丁箕１，郑永刚１，王　勤２
（１．达州市动物疫病预防控制中心，四川达州６３５０００；
２．达州市职业技术学院，四川达州６３５０００）
摘　要：为检验和提升达州市兽医实验室检测能力，达州市动物疫病预防控制中心组织全市７个县级兽医实验室开展了Ｈ５亚型禽流感抗体（ＨＡ－ＨＩ）、Ｏ型口蹄疫抗体（ＥＬＩＳＡ）和非洲猪瘟病毒核酸（ＲＴ－ＰＣＲ）三项检测试验能力比对。结果显示：Ｈ５－ＡＩＡｂ、Ｏ－ＦＭＤＡｂ和ＡＳＦＶ核酸检测符合率分别为９４．２９％、９４．２９％、８８．５７％。结果表明，县级兽医实验室ＨＩ和ＥＬＩＳＡ方法掌握较好，而ＲＴ－ＰＣＲ检测病毒核酸的技术有待提高。关键词：兽医实验室；检测能力；比对ｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０２１．０４．００３  引言
开展兽医实验室检测能力比对，是评价兽医实验室检测技术水平，加强兽医实验室质量控制的有效方法
［１］
，更是强化兽核酸检测结果阳性参考值阴性
医实验室检测能力建设，提升动物疫病监测预警水平的重要举
措［２］
。２０２０年１０月，达州市动物疫病预防控制中心组织全市
７个县级兽医实验室进行了检测能力比对，并对检测结果进行分析，以期有针对性地改进提高。  材料与方法１ １　比对项目
共设Ｈ５亚型禽流感抗体（Ｈ５－ＡＩＡｂ）、Ｏ口蹄疫抗体（Ｏ－ＦＭＤＡｂ）和非洲猪瘟病毒（ＡＳＦＶ）核酸检测３个比对项目。其中Ｈ５－ＡＩＡｂ检测采用ＨＩ方法，按照《高致病性禽流
感诊断技术》（ＧＢ／Ｔ１８９３６－２００３）进行［３］；Ｏ－ＦＭＤＡｂ检测采
用竞争ＥＬＩＳＡ方法、ＡＳＦＶ核酸检测采用ＲＴ－ＰＣＲ方法，参照试剂盒说明书进行。１ ２　比
对材料１ ２ １　检测试剂
市中心统一提供禽流感病毒Ｈ５亚型（Ｒｅ－１１）血凝抑制试验抗原（哈尔滨维科生物技术有限公司、批号２０１９００９）和标准阴性、阳性血清；口蹄疫病毒Ｏ型竞争ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂
盒（批号０２００９２０１７）和非洲猪瘟病毒荧光ＰＣＲ检测试剂盒（批号０４０２２２０１２）由青岛立见诊断技术发展中心提供；ＤＮＡ提取试剂由各实验室自备。１ ２ ２　比对样品
每个项目每个县准备比对样品５份，并设置重复样品。其中Ｈ５－ＡＩＡｂ检测比对样品抗体滴度设置 １ｌｏｇ２、４ｌｏｇ２和７ｌｏｇ２３个参考值（哈尔滨维科生物技术有限公司制备）；Ｏ－ＦＭＤＡｂ、ＡＳＦＶ核酸检测比对样品设置阴性、阳性和弱阳性３个参考值（青岛立见诊断技术发展中心制备）。经市中心验证后制备盲样。１ ３　评判标准
Ｈ５－ＡＩＡｂ检测：检测结果与参考值一致或±１；Ｏ－ＦＭＤＡｂ和ＡＳＦＶ检测：阳性、弱阳性样品检测结果为“阳性”，阴性样品检测结果为“阴性”。  结果２ １　总体结果
３个比对项目平均符合率９２．３３％，Ｈ５－ＡＩＡｂ、Ｏ－ＦＭＤＡｂ、ＡＳＦＶ核酸检测符合率分别为９４．２９％、９４．２９％、８８．５７％。２个县全部正确，３个县符合率为９３．３３％，如表１所示。
表１　各县实验室比对结果统计
县别Ｈ５－ＡＩＡｂ
检测数正确数符合率／％Ｏ－ＦＭＤＡｂ
检测数
正确数符合率／％ＡＳＦＶ核酸
检测数正确数符合率／％总体结果
检测数正确数符合率／％Ａ５５１００５４８０５４８０１５１３８６．６７Ｂ５５１００５４８０５５１００１５１４９３．３３Ｃ５５１００５５１００５５１００１５１５１００Ｄ５５１００５５１００５４８０１５１４９３．３３Ｅ５５１００５５１００５５１００１５１５１００Ｆ５３６０５５１００５４８０１５１２８０Ｇ５５１００５５１００５４８０１５１４９３．３３合　计
３５
３３
９４．２９
３５
３３
９４．２９
３５
３１
８８．５７
１０５
９７
９２．３８
４
２０２１年第４期（总第３８３期）畜禽业试验研究
２ ２　Ｈ５－ＡＩＡｂ
２个实验室检测结果与参考值完全一致；参考值为７ｌｏｇ２的样品，１个实验室检测结果相差２个滴度，３个实验室相差１个滴度；参考值为４ｌｏｇ２的样品，５个实验室相差１个滴度。各实验室的重复样品，检测结果一致。
２ ３　Ｏ－ＦＭＤＡｂ
有５个实验室Ｏ－ＦＭＤＡｂ检测结果全部正确；Ａ县１份阴性样品检测为阳性，Ｂ县将１份弱阳性检测为阴性。
２ ４　ＡＳＦＶ核酸
３个实验室检测结果与参考值完全一致；另外４个县弱阳性样品检测结果为阴性。各县强阳性和阴性样品检测结果较准确，弱阳性的检出率低。
　讨论
从比对结果看，达州市县级兽医实验室具备此３种方法检测相应动物疫病的能力。但个别实验室个别项目检测结果仍有偏差，还需查原因加以改进提高。
血凝抑制试验受器材、稀释液、抗原、待检血清、红细胞、人员操作及其他因素影响，试验结果易出现偏差［４］。个别实验室测定抗原滴度较高，导致比对结果抗体滴度偏高。个别样品检测结果偏倚方向与其余４份样品不一致，可能是由于加样不准确或主观结果判读有误导致。而ＥＬＩＳＡ试验不易受主观因素影响，个别样品结果有误可能是加样造成污染或加样量不足导致。
为适应非洲猪瘟防控需要，２０２０年达州市首次将ＲＴ－ＰＣＲ方法纳入比对项目。但ＡＳＦＶ弱阳性样品符合率较低，而影响ＲＴ－ＰＣＲ试验的因素包括检测试剂和检测仪器的灵敏度、样品的病毒含量及人员操作等。本次出现假阴性的可能原因有如下几点。一是弱阳性样品ＣＴ值接近临界值，病毒含量低，各县核酸提取试剂的提取效率不同导致个别实验室检测失败。二是个别实验室购置的简易ＲＴ－ＰＣＲ检测仪器灵敏度有待比对，移液器等未定期进行质量检定。三是病毒核酸检测技术刚在县级实验室普及，操作不熟练。工作实践中，环境、唾液、猪肉产品等样品病毒含量通常较低，所以病毒核酸检测能力急需提高。
　结语
达州市县级兽医实验室检测能力仍需加强。一是强化实验室建设，配置精良仪器设备并定期检定更新。
二是定期开展培训，提升人员素养。定期开展实验室间、检测人员间、仪器设备间比对，及时发现问题整改。三是完善实验室质量管理体系和生物安全管理体系，严格操作程序，规范实验活动。
参考文献：
［１］　王文，张继红，兰玲，等．２０１０年新疆兽医系统实验室检测能力比对试验的探讨与建议［Ｊ］．中国动物检疫，
２０１１，２８（９）：１９－２１．
［２］　程果，赵美雪，朱前磊，等．２０１８年河南省兽医系统实验室检测能力比对结果分析［Ｊ］．中国动物检疫，２０１９（５）：
２９－３３．
［３］　农业部．ＧＢ／Ｔ１８９３６－２００３高致病性禽流感诊断技术［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２００３．
［４］　雷莉辉．影响血凝试验和血凝抑制试验的因素分析［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１３，４０（６）：２４４－２４６．
作者简介：
赵小波（１９８８—），男，四川达州人，本科，兽医师，从事动物监测与防控工作。
刘俐君（１９８２—），女，重庆涪陵人，硕士研究生，高级兽医师，从事动物监测与防控工作。
（上接第３页）
鼠的临床表现。
３）每２ｈ记录小白鼠的精神状态、进食状况等临床表现，连续观察１５ｄ，记录各小组内小白鼠的死亡情况。
４）发生死亡后对小白鼠进行解剖观察，并将小白鼠的各器官组织在无菌条件下取出后将其制作为病理切片，并再次对其进行细菌分离并鉴定。
　实验结果分析
１）根据培养基的培养特性以及革兰染结果来判断分离菌株是否符合大肠杆菌的特征。镜检时看到菌落为短小杆菌，革兰氏呈阴性。把分离细菌之后的培养物接种在麦康凯培养基上并维持３７℃进行培养
后，菌落表面光滑，呈现湿润的粉红且菌落的边缘整齐；将其接种到伊红美兰琼脂上并维持３７℃进行培养后，菌落光滑反光，呈现黑或者棕绿；接种在ＳＳ培养基上，维持３７℃进行培养后菌落不生长。这些都是符合大肠杆菌的形态以及生理特征。此外对于可疑菌落要对其单独进行氧化酶等实验并使用鉴定系统对其进行鉴定。
２）血清型的鉴定结果要根据玻片凝集实验的结果对猪源致病性大肠杆菌的血清型以及菌株类型进行具体的分析。毒力基因检测、药物的敏感性分析都要根据实验的具体结果进行讨论分析。
３）小白鼠的致病性实验通过实验组与对照组的对比，更为直观地展示了猪源致病性大肠杆菌对动物体内各器官组织的危害。通过该实验可以发现猪源致病性大肠杆菌对小白鼠具有很强的致病性，猪源致病性大肠杆菌对人类和动物存在着极大的威胁，应该引起人们的关注。
　结语
根据上文所述，猪源致病性大肠杆菌的鉴定与分离方法有了一个较为详尽的思路，但是也应该看到猪源致病性大肠杆菌的研究任重而道远，对于该类细菌的研究已经涉及到了众多学科，包括动物医学、食品卫生安全学以及人类医学等。在当前医疗技术手段下，对于猪源致病性大肠杆菌的感染还没有行之有效的方案和药物，因此人类和动物的预防感染就显得尤为重要，而要想加强对食品安全的监督与检测，就必须寻更加高效的针对猪源致病性大肠杆菌的鉴定方法和检测手段。
参考文献：
［１］　周磊，李泽伟，孙起荣，等．５４株猪源肠外致病性大肠杆菌血清型、系统进化和基因型［Ｊ］．微生物学通报，２０２１，２８（１）：１－１６．
［２］　徐树培，曾梅，吴让忠，等．西昌市鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析［Ｊ］．畜禽业，２０２０，３１（１１）：１－３．
作者简介：
刘桂梅（１９７３—），女，陕西渭南人，本科，实验师，研究方向：高职畜牧兽医专业实验实训教学。
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