新型冠状病毒肺炎患者不同类型样本病毒核酸检测结果分析
摘要 目的 探讨不同生物样本对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测结果的影响。方法 选择2020年1月30日至3月2日我院收治并确诊的新型冠状病毒肺炎病例（COVID-19）38例，设计针对SARS-CoV-2核酸 ORF1ab/N 基因引物，通过实时荧光逆转录聚合酶链反应检测技术检测患者咽拭子、粪便、血浆、尿液等标本中病毒核酸含量，采用χ2检验比较不同生物样本的阳性率差异。结果 咽拭子和粪便样本病毒核酸检测阳性率分别为41.3%（114/276）和30.3%（33/109），两样本检出率差异有统计学意义（P<0.05）。仅在一份痰液样本中检测到SARS-CoV-2，在血浆和尿液样本中未检测到SARS-CoV-2核酸。38例患者经多次复查，咽拭子和粪便样本病毒核酸检测阳性率分别为84.2%（32/38），和42.9%（15/35），两样本检出率差异有统计学意义（P<0.05）。结论 咽拭子可作为SARS-CoV-2检测的主要临床样本，粪便标本作为咽拭子标本的补充；多次复查生物样本，可提高病毒核酸的检出率。
关键词：新型冠状病毒；生物样本；咽拭子；粪便
核酸检测结果阳性参考值阴性 新型冠状病毒肺炎是由2019新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的呼吸道传染性疾病，其以发热、乏力、干咳等症
关键词：新型冠状病毒；生物样本；咽拭子；粪便
核酸检测结果阳性参考值阴性 新型冠状病毒肺炎是由2019新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的呼吸道传染性疾病，其以发热、乏力、干咳等症
状为主要临床表现。截止2020年5月3日，国内累计报告新型冠状病毒肺炎确诊患者82880例，累计死亡4633例，输入确证患者1675例，目前我国疫情呈可控状态，但输入性风险仍较高[1]，海外新型冠状病毒肺炎确诊患者2074673例，累计死亡235147例。该病作为急性呼吸道传染疾病已被列入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按管理[2]。实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性是诊断新型冠状病毒感染的“金标准”。在《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》(试行第七版)中提到鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病毒核酸[3]。本研究拟利用实时荧光定量 RT-PCR 方法检测新冠肺炎患者体内不同生物样本携带病毒情况，为咽拭子和粪便等样本作为SARS-CoV-2检测的主要临床标本提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料 38例COVID-19患者中，男18例，女20例，3-79岁，中位年龄38岁，无症状感染者2例，轻型2例，普通型30例，重型2例，危重型2例，患者以发热、咳嗽、咳痰、流涕和肌肉酸痛为主要临床表现。
1.2 标本来源 采集2020年1月30日至3月2日期间昆明市第三人民医院确诊的38例新冠肺炎患者的咽拭子、粪便、血液及尿液进行研究，总的收集到咽拭子样本276份，血液样本经离心
1 资料与方法
1.1 临床资料 38例COVID-19患者中，男18例，女20例，3-79岁，中位年龄38岁，无症状感染者2例，轻型2例，普通型30例，重型2例，危重型2例，患者以发热、咳嗽、咳痰、流涕和肌肉酸痛为主要临床表现。
1.2 标本来源 采集2020年1月30日至3月2日期间昆明市第三人民医院确诊的38例新冠肺炎患者的咽拭子、粪便、血液及尿液进行研究，总的收集到咽拭子样本276份，血液样本经离心
后获得血浆样本80份，尿液样本74份，粪便样本109份，痰液样本19份。
1.3 样本采集 主管医生在三级防护条件下，在隔离病房采集患者咽拭子、粪便、血液和尿液进行核酸检测。样本采集、运送及存储均按照 Ａ 类高致病性病原微生物管理。
1.4 试剂和仪器 病毒 RNA 提取试剂盒、荧光定量 RT-PCR 试剂均为苏州天隆生物科技有限公司提供。采用天隆核酸扩增(GENTIER 96)和CFX96 Real-Time System仪进行实时荧光定量 PCR 扩增。
1.5 核酸提取及产物扩增 按照国家卫生健康委员会办公厅《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》[4]要求在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护。使用天隆(TIANLONG)全自动核酸提取仪，严格按照试剂说明书进行提取。选用针对SARS-CoV-2病毒的 ORF1ab 和核壳蛋白 N 基因区域的引物和探针。反应体系为：主反应液17ul，荧光探针1.5ul，酶混合液1.5ul。扩增条件为：50℃ 30min；95℃ 10min；94℃ 15s，50℃ 30s，72℃ 30s，5个循环；94℃ 10s，58℃ 30s，40个循环。
1.6 结果判读 质控在控，检测样本的内标 Ct 值应＜40是前提，在满足上述条件后，实验成功。如果待测样本检测结果FAM通道和VIC通道Ct值均小于等于37，且曲线呈S型且有明显指数增长期，则可判断为新冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸阳性；如果待测标本FAM通道和
1.3 样本采集 主管医生在三级防护条件下，在隔离病房采集患者咽拭子、粪便、血液和尿液进行核酸检测。样本采集、运送及存储均按照 Ａ 类高致病性病原微生物管理。
1.4 试剂和仪器 病毒 RNA 提取试剂盒、荧光定量 RT-PCR 试剂均为苏州天隆生物科技有限公司提供。采用天隆核酸扩增(GENTIER 96)和CFX96 Real-Time System仪进行实时荧光定量 PCR 扩增。
1.5 核酸提取及产物扩增 按照国家卫生健康委员会办公厅《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》[4]要求在生物安全二级实验室进行，同时采用生物安全三级实验室的个人防护。使用天隆(TIANLONG)全自动核酸提取仪，严格按照试剂说明书进行提取。选用针对SARS-CoV-2病毒的 ORF1ab 和核壳蛋白 N 基因区域的引物和探针。反应体系为：主反应液17ul，荧光探针1.5ul，酶混合液1.5ul。扩增条件为：50℃ 30min；95℃ 10min；94℃ 15s，50℃ 30s，72℃ 30s，5个循环；94℃ 10s，58℃ 30s，40个循环。
1.6 结果判读 质控在控，检测样本的内标 Ct 值应＜40是前提，在满足上述条件后，实验成功。如果待测样本检测结果FAM通道和VIC通道Ct值均小于等于37，且曲线呈S型且有明显指数增长期，则可判断为新冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸阳性；如果待测标本FAM通道和
VIC通道，其中仅有一个通道的检测结果Ct值≤37，此时样本应进行重复检测，如重复检测结果显示两个通道Ct值均≤37，曲线呈S型且有明显指数增长期，则判断为新冠状病毒 （SARS-CoV-2）核酸阳性；如果仍然一个通道检测为阳性，则该样本为可疑样本，应通过其他方法如测序进行序列鉴定；阴性：如果两个通道检测Ct值无数值，内标通道检测结果为阳性，此次结果判断为新冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸阴性，但不排除其他冠状病毒感染的可能。
1.7 统计分析 使用SPSS17.0统计软件，计数资料以率表示，采用χ2检验比较率的差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同生物样本的2019-nCoV核酸检测 38例新冠肺炎患者总的采集到咽拭子样本276份，血浆样本80份，尿液样本74份，粪便样本109份，痰液样本19份。咽拭子样本和粪便样本病毒核酸检测阳性率分别为41.3%（114/276）和30.3%（33/109），两样本检出率差异有统计学意义（P<0.05），见表1。仅在一份痰液样本中检测到2019-nCoV，在血浆和尿液样本中未检测到2019-nCoV核酸。
1.7 统计分析 使用SPSS17.0统计软件，计数资料以率表示，采用χ2检验比较率的差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同生物样本的2019-nCoV核酸检测 38例新冠肺炎患者总的采集到咽拭子样本276份，血浆样本80份，尿液样本74份，粪便样本109份，痰液样本19份。咽拭子样本和粪便样本病毒核酸检测阳性率分别为41.3%（114/276）和30.3%（33/109），两样本检出率差异有统计学意义（P<0.05），见表1。仅在一份痰液样本中检测到2019-nCoV，在血浆和尿液样本中未检测到2019-nCoV核酸。
3 讨论
在这次防治疫情的过程中，我们发现SARS-CoV-2病毒的确诊至关重要。病毒培养耗时长，培养条件苛刻，所需实验室等级较高，一般的二级实验室无法开展，无法实现大规模病例检测；血清中SARS-CoV-2病毒特异性抗体IgM和IgG产生需要时间，在新冠肺炎早期诊断中意义不大[5]。RT-PCR检测病毒核酸快速，成为临床检测SARS-CoV-2病毒的主要手段。《新冠肺炎病毒感染的肺炎诊疗方案》试行第七版提到鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便等样本可作为检测病毒核酸的生物样本。据报道，新型冠状病毒感染的患者，病毒核酸检测只有30% ～ 50% 的阳性率[6]。本研究中对38例新冠肺炎患者反复行咽拭子、痰液、血液、尿液和粪便病毒核酸检测，总的采集到咽拭子样本276份，血浆样本80份，尿液样本74份，粪便样本109份，痰液样本19份，咽拭子样本病毒核酸检测阳性率为41.3%，粪便样本为30.3%，仅在一份痰液样本中检测到SARS-CoV-2，在血浆和尿液样本中未检测到SARS-CoV-2核酸。这些结果表明咽拭子和粪便样本可作为SARS-CoV-2核酸检测的临床生物样本，血浆和尿液作为检测样本有待进一步研究，痰液作为SARS-CoV-2核酸检测样本持保留意见，因为有报道称[7]在新冠肺炎检测中，痰标本的病毒含量高于咽拭子标本，其检测效果优于咽拭子标本，这与本研究不符，可能的原因是本研究中痰液样本较少，存在采集不
在这次防治疫情的过程中，我们发现SARS-CoV-2病毒的确诊至关重要。病毒培养耗时长，培养条件苛刻，所需实验室等级较高，一般的二级实验室无法开展，无法实现大规模病例检测；血清中SARS-CoV-2病毒特异性抗体IgM和IgG产生需要时间，在新冠肺炎早期诊断中意义不大[5]。RT-PCR检测病毒核酸快速，成为临床检测SARS-CoV-2病毒的主要手段。《新冠肺炎病毒感染的肺炎诊疗方案》试行第七版提到鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便等样本可作为检测病毒核酸的生物样本。据报道，新型冠状病毒感染的患者，病毒核酸检测只有30% ～ 50% 的阳性率[6]。本研究中对38例新冠肺炎患者反复行咽拭子、痰液、血液、尿液和粪便病毒核酸检测，总的采集到咽拭子样本276份，血浆样本80份，尿液样本74份，粪便样本109份，痰液样本19份，咽拭子样本病毒核酸检测阳性率为41.3%，粪便样本为30.3%，仅在一份痰液样本中检测到SARS-CoV-2，在血浆和尿液样本中未检测到SARS-CoV-2核酸。这些结果表明咽拭子和粪便样本可作为SARS-CoV-2核酸检测的临床生物样本，血浆和尿液作为检测样本有待进一步研究，痰液作为SARS-CoV-2核酸检测样本持保留意见，因为有报道称[7]在新冠肺炎检测中，痰标本的病毒含量高于咽拭子标本，其检测效果优于咽拭子标本，这与本研究不符，可能的原因是本研究中痰液样本较少，存在采集不
合格的情况。此外，在本研究中，常有采集的患者咽拭子和粪便样本新型冠状病毒核酸检测结果时阳时阴，究其原因，笔者进行了以下原因分析：1、检验前：①标本采集不合格，取材前患者饮水、进食等均会影响标本中病毒载量，取样部位不准确也会导致病毒的检出率下降；②标本运输时间过长或保存条件不符会导致病毒核酸RNA降解，导致检出率的下降。2、检验中：①不同公司生产的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒检出率不同；②RT-PCR核酸检测方法特异性强，灵敏度高，但易受污染；③核酸提取方法的影响，自动法、手工提取以及试剂盒不同，均会导致提取的病毒核酸含量不同。3、检验后：全程质量控制未严格把控。
38例患者经多次复查，咽拭子和粪便样本病毒核酸检测阳性率分别为84.2%（32/38），和42.9%（15/35），两样本检出率差异有统计学意义，咽拭子样本病毒核酸检测阳性率高于粪便样本。咽拭子和粪便样本检测结果不一致可能是受患者生理因素影响，据报道，多数经过呼吸道感染的病毒后期有粪便排毒的特点[8]，因此粪便样本在疾病中晚期采集检测意义较大。此外，本研究表明多次采集临床生物样本进行复查可提高病毒核酸的检出率。
综上，咽拭子和粪便样本可作为临床检测SARS-CoV-2的主要临床样本，痰、血液和尿液样本的检测意义有待进一步研究，多次复查生物样本，可提高病毒核酸的检出率。
38例患者经多次复查，咽拭子和粪便样本病毒核酸检测阳性率分别为84.2%（32/38），和42.9%（15/35），两样本检出率差异有统计学意义，咽拭子样本病毒核酸检测阳性率高于粪便样本。咽拭子和粪便样本检测结果不一致可能是受患者生理因素影响，据报道，多数经过呼吸道感染的病毒后期有粪便排毒的特点[8]，因此粪便样本在疾病中晚期采集检测意义较大。此外，本研究表明多次采集临床生物样本进行复查可提高病毒核酸的检出率。
综上，咽拭子和粪便样本可作为临床检测SARS-CoV-2的主要临床样本，痰、血液和尿液样本的检测意义有待进一步研究，多次复查生物样本，可提高病毒核酸的检出率。
参考文献
[1] 国家卫生健康委员会.截止5月3日24时新型冠状病毒肺炎疫情通报[EB/OL].[2020-05-03].
[2] 赵林，向瑜，赖晓霏，周发春．COVID-19 疫情下临床检验面对的挑战与对策．检验医学与临床. knski/kcms/detail/50.1167.R.20200303.2206.002.html.
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[4] 中华人民共和国卫生健康委员会办公厅. 新型冠状病毒实验室生物安全指南[EB/OL].（2020-01-23）
[5] 施绍瑞，聂滨，郭渝等.新型冠状病毒肺炎病例多种生物样本的病毒核酸检测结果[J]. 华西医学, 2020, 35（2）：132-136.
[6] 张思玮．诊断新冠肺炎，CT不能替代核酸检测［N/OL］．中国科学报．( 2020-02-10) ［2020-03-01］．
[7] 陈炜，张春阳，朱颖等. 4例新型冠状病毒感染病例咽拭子与痰标本病毒核酸检测的比较[J/OL]. 中国人兽共患病学报.（2020-02-12）[2020-03-01].
[8] 张鹏超. H1N1、H1N2亚型猪流感病毒的分离鉴定及H1N2分离株在猪体内分布规律的调查[D].南京:南京农业大学，2011，S1，1-83.
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