流感病毒的核酸检测技术操作规范
（一）流感病毒Conventional one step RT-PCR检测
应用核酸检测技术为疑似流感病毒感染病例诊断提供依据，为流感病毒的型别和亚型的鉴定提供技术方法。按照规定方法对标本和病毒进行处理和检测，保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。
1. 生物安全要求
实验室操作应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。季节性流感病毒生物安全二级，疑似高致病禽流感病例标本需在BSL-2级实验室操作，采取BSL-3级防护；核酸提取及加RNA模板可在BSL-2级实验室生物安全柜内操作；PCR反应体系配制在体系配制区；PCR产物检测在电泳区操作。
2. 主要试剂（所列厂家仅用作举例，实验室可自行选择）
注：*引物序列详见表1。
3. 设备
（1）BSL-2生物安全柜；
（2）可调转速最大至14000rmp的离心机；
（3）涡旋混合器；
（4）10μL，100μL，200μL，1000μL量程移液器；
（5）PCR仪；
（6）电泳槽和电泳仪；
（7）凝胶成像系统。
4. 质量控制
（1）实验检测所需核酸提取试剂和一步法RT-PCR检测试剂不同批号之间需进行灵敏度的检测。同一试剂不同批次的灵敏度的检测至少半年一次。
（2）实验检测除待检标本外还需设置阳性对照及阴性对照，阳性对照核酸事先应稀释分装，经Real-time PCR检测Ct值在30以内；阴性对照为DEPC处理水Real-time PCR检测Ct值为0。
5. 实验步骤
（1）实验注意事项
由于PCR检测灵敏度高，因此必须采取一些预防污染的措施，以避免假阳性结果的出现，建议采取如下方法：
a) 核酸提取、反应液配制及检测反应进行应在独立的房间中进行。
b) 不同的房间配制相应的专用耗材和设备，不可交叉
使用。
c) 配制反应液时，应穿着干净的实验服，带无粉手套进行操作。
d) 实验操作期间，如怀疑有污染，请更换手套。
e) 试剂及反应管的盖子应尽可能盖上。
（2）设备准备
操作台的表面、头和离心机应保持洁净，可用5%漂白剂或其它清洁剂，如可以去除DNA酶的试剂擦拭台面，以减少核酸污染的风险。
（3）试剂准备
注意：配制反应液期间，尽量保持所有试剂放置在低温装置中，如预冷的冰盒。
a) 引物配制
将新合成的引物在开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100pmol/μL，即100μM。（例如：合成引物2OD，9.5nmol，则加水量为10×9.5＝95μL），可作为储存液。将100μM的引物浓度再10倍稀释，配成浓度为10μM，即可直接用于PCR反应。
b) 引物准备
融化引物，振荡所有引物，短暂离心引物，然后放置在低温装置上。
c) Conventional RT-PCR试剂
将RT-PCR Enzyme Mix放置在低温装置上，融化5×RT-PCR Buffer，颠倒混匀。短暂离心5×RT-PCR Buffer后放置在低温装置上。
（4）反应体系配制
a) 按照如下组分配制反应体系：
组分体积（μL）5×RT-PCR Buffer 5×n
10mM dNTP Mixture 1×n
RT-PCR Enzyme Mix 1×n
RNase Inhibitor 0.1×n
上游引物0.5×n
下游引物0.5×n
RNase Free Water 11.9×n
Total 20×n
核酸检测结果阳性参考值阴性b) 将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。
c) 加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
（5）一步法Conventional RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR扩增，反应程序如下：
（6）RT-PCR产物检测
a) 1.5％琼脂糖凝胶制备：称取1.5g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料（Gold View）5μL，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶的温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
b) 将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。
发表评论