呼吸道病原体多重核酸检测方法在社区
获得性肺炎患儿诊断中的应用
赵延如１，４，李洁琼１，刘　芳２，吴喜蓉３，赵志鹏３，尹青琴３，王咏红１，马　琦１，
全舒婷１，王亚翠１，孙　琳１，申阿东１
（１．首都医科大学附属北京儿童医院呼吸感染疾病研究室北京市儿科研究所儿科学国家重点学科教育部儿科重大疾病研究重点实验室儿童呼吸道感染性疾病研究北京市重点实验室，北京１０００４５；２．首都医科大学附属北京儿童医院介入肺科，北京１０００４５；３．首都医科大学附属北京儿童医院呼吸科，北京１０００４５；４．天津市急救中心，天津３０００１１）
摘要：目的　评价呼吸道病原体多重核酸检测方法在社区儿童获得性肺炎（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｃｑｕｉｒｅｄｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ＣＡＰ）诊断中的价值。方法　纳入２０１８年５月至１２月于首都医科大学附属北京儿童医院住院的ＣＡＰ患儿３５４例，采集痰液等标本，采用呼吸道病原体多重核酸检测方法，并分别评价其在肺炎支原体肺炎（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ＭＰＰ）和病毒性肺炎中诊断的灵敏度和特异性，以及分析其与七项呼吸道病原检测方法的一致性。结果　１５５例ＭＰＰ组患儿，１５２例病原体核酸检测ＭＰ阳性，即灵敏度为９８．１％；以病毒性肺
炎和细菌性肺炎患儿为非ＭＰＰ对照组，病原体核酸检测结果显示ＭＰ阳性４例，特异性为９８．０％（１９５／１９９）。１５８例病毒性肺炎患儿，病原体核酸检测出病毒１４１例，灵敏度为８９．２％。以ＭＰＰ和细菌性肺炎患儿为非病毒性肺炎对照组，１９６例患儿病原体核酸检测检出病毒３９例（１９．９％），特异性为８０．１％。１５８例病毒性肺炎患儿中９９份标本其病原体核酸检测结果与病毒抗原检测结果完全一致。５９例不一致结果以病毒抗原检测为单一感染而病毒核酸检测为混合感染为主（３０例），且主要来源于病毒抗原检测方法所不涵盖的其他病毒感染。结论　呼吸道病原体多重核酸检测在ＭＰＰ诊断中具有较高的灵敏度和特异性；与传统的病毒抗原检测相比，虽存在一定的假阴性，但具有高通量检测的优势，可同时完成更多种病毒类型的检出；具有快速、灵敏度高等特点，可以为儿童呼吸道病原体的诊断以及鉴别诊断提供很好的证据。
关键词：社区获得性肺炎；　儿童；　多重核酸检测；　诊断；　病原体
中图分类号：Ｒ３７２；Ｒ７２５．６  文献标识码：Ａ
ＴｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｕｌｔｉｐｌｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ＰａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｔｈｅＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＣｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈＣＡＰＺＨＡＯＹａｎｒｕ１，４，ＬＩＪｉｅｑｉｏｎｇ１，ＬＩＵＦａｎｇ２，ＷＵＸｉｒｏｎｇ３，ＺＨＡＯＺｈ
ｉｐｅｎｇ３，ＹＩＮＱｉｎｇｑｉｎ３，ＷＡＮＧＹｏｎｇｈｏｎｇ１，ＭＡＱｉ１，ＱＵＡＮＳｈｕｔｉｎｇ１，ＷＡＮＧＹａｃｕｉ１，ＳＵＮＬｉｎ１，ＳＨＥＮＡｄｏｎｇ１［１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｊｏｒＤｉｓｅａｓｅｓｉｎＣｈｉｌｄｒｅｎａｎｄＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＤｉｓｃｉｐｌｉｎｅｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃｓ（ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＢｅｉｊｉｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＩｎｆｅｃｔｉｏｎＤｉｓｅａｓｅｓ，ＢｅｉｊｉｎｇＰｅｄｉａｔｒｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＢｅｉｊｉｎｇＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４５，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌＰｕｌｍｏｎｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＢｅｉｊｉｎｇＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４５，Ｃｈｉｎａ；３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４５，Ｃｈｉｎａ；４．ＴｉａｎｊｉｎＥｍｅｒｇｅｎｃｙＣｅｎｔｅｒ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００１１，Ｃｈｉｎａ］
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃｑｕｉｒｅｄｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ＣＡＰ）
ｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＦｒｏｍＭａｙ，２０１８ｔｏＤｅｃｅｍｂｅｒ，２０１８，ａｔｏｔａｌｏｆ３５４ｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈＣＡＰａｄｍｉｔｔｅｄｔｏＢｅｉｊｉｎｇＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌｗｅｒｅｅｎｒｏｌｌｅｄｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙ．Ｓｐｕｔｕｍａｎｄｏｔｈｅｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｔｒａｃｔｐａｔｈｏｇｅｎｍｕｌｔｉｐｌｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｔｅｓｔｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈ
ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０２０．１２．００３
收稿日期：２０２０ １０ ０４；修回日期：２０２０ １１ ０２
基金项目：十三五重大专项课题（编号：２０１８ＺＸ１０１０３００１ ００３）
作者简介：赵延如。Ｅ ｍａｉｌ：５４５１４８０２３＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者：申阿东。Ｅ ｍａｉｌ：ｓｈｅｎａｄ１６＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ；
孙琳。Ｅ ｍａｉｌ：ｃｈｉｎａｔｋａ＠１６３．ｃｏｍ
核酸检测结果阳性参考值阴性
ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ＭＰＰ）ａｎｄｖｉｒａｌｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙｏｆｒｅｓｕｌｔｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．ＲｅｓｕｌｔｓＡｍｏｎｇ１５５ｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈＭＰＰ，１５２ｃａｓｅｓｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＭＰｕｓｉｎｇｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎａｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆ９８．１％．Ｗｈｅｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈｖｉｒａｌｐｎｅｕｍｏｎｉａａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｐｎｅｕｍｏｎｉａａｓｔｈｅｎｏｎ ＭＰＰｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｆｏｕｒｃａｓｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｓＭＰｐｏｓｉｔｉｖｅｕｓｉｎｇｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎａｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆ９８．０％（１９５／１９９）．Ｉｎ１５８ｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈｖｉｒａｌｐｎｅｕｍｏｎｉａ，１４１ｃａｓｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆ８９．２％．ＷｈｅｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈＭＰＰａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｐｎｅｕｍｏｎｉａａｓｔｈｅｎｏｎ ｖｉｒａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，３９ｃａｓｅｓ（１９．９％）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｓｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎａｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆ８０．１％．Ａｍｏｎｇｔｈｅ１５８ｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈｖｉｒａｌｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａ，ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｔｅｓｔａｎｄｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎ９９ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｏｆｔｈｅ５９ｃａｓｅｓｗｉｔｈｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓ，３０ｃａｓｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｓｉｎｇｌｅｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎｂｕｔｍｕｌｔｉｐｌｅｖｉｒｕｓｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔｈａｓａｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｉｎＭＰＰｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｗｈｅｎｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｉｔｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｓａｂｌｅｔｏｄｅｔｅｃｔｍｏｒｅｖｉｒｕｓｔｙｐｅｓｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ｄｅｓｐｉｔｅｔｈｅｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓ．ＩｔｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｓｔｒｏｎｇｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＣＡＰｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｃｑｕｉｒｅｄｐｎｅｕｍｏｎｉａ；　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ；　ＭｕｌｔｉｐｌｅＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ；　Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
  社区获得性肺炎（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｃｑｕｉｒｅｄｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ＣＡＰ）是儿童常见
的呼吸系统疾病，同时是导致５岁以下儿童死亡的常见原因，严重威胁儿童的生长发育和生命健康［１］。一项关于全球下呼吸道感染疾病负担的研究指出，下呼吸道感染对儿童尤其是５岁以下儿童危害严重，据估算２０１５年该病造成约７０万儿童死亡［２］。呼吸道感染的病原体构成复杂，临床症状缺乏特异性。传统的病原学诊断常通过病原体分离培养实现，该方法耗费时间长，且鉴定数量有限，难以满足临床诊断需求，亟需研发新的诊断方法。
  近几年来，通过核酸检测呼吸道病原体的方法发展迅速，分子生物学方法不断创新和优化，从应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）、核酸杂交、实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等技术测定特定病原体的核酸到多重ＰＣＲ同时实现多病原的检测。特定病原体基因检测存在通量小的弊端，而多重ＰＣＲ兼具普通ＰＣＲ简单高效和高通量的优点，该方法在基因检测领域备受关注。因此基于该技术，研发一种更灵敏和特异、高通量的呼吸道病原体的检测方法，可为临床早期快速诊断、呼吸道疾病提供有效的方法。
  本研究所采用的呼吸道病原体多重核酸检测试剂盒，是基于多重ＲＴ ＰＣＲ与毛细管电泳联用技术，可实现呼吸道病原体的多重定量检测。其原理为以病原体基因的高度保守序列为靶区域，分别设计特异性引物，在同一个扩增管中进行一步法扩增；采用毛细电泳分离不同长度的扩增产物，得到病原体的检测结果。因此该方法可实现多病原的同时检测。本文通过纳入ＣＡＰ患儿，评价该方法在多病原检测中的准确性，为今后临床的早期快速检测提供一定的辅助方法。
材料和方法
  １　研究设计
  纳入２０１８年５月至２０１８年１２月期间，于首都医科大学附属北京儿童医院住院的ＣＡＰ患儿，采集其呼吸道样本，包括痰液和肺泡灌洗液标本。采用呼吸道病原体多重核酸检测试剂盒进行检测，在肺炎支原体肺炎组和非肺炎支原体对照组，分析该方法检测肺炎支原体的准确性；在病毒性肺炎组和非病毒肺炎对照组，比较该方法与七项病毒抗原检测方法检测病毒病原的一致性。本研究经我院医学伦理委员会批准，涉及的检查均取得了患儿监护人的知情同意。
  ２　纳入标准
  ２．１　肺炎支原体肺炎（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ＭＰＰ）患儿纳入标准　符合儿童ＣＡＰ诊断标准［３ ４］且同时满足ＭＰ抗体（ＭＰ Ａｂ）阳性（滴度≥１∶１６０或大环内酯类抗生素４周内双份血清抗体４倍及以上升高或下降）和ＭＰ ＲＮＡ阳性。
  ２．２　病毒性肺炎患儿纳入标准　符合儿童ＣＡＰ诊断标准［３ ４］，且同时满足七项呼吸道病毒抗原检测至少一项阳性，临床诊断病毒性肺炎。
  ３　肺炎支原体肺炎检测
  ３．１　ＭＰ核酸检测（ＭＰ ＳＡＴ）　将浸泡过咽拭子的生理盐水加入到裂解液。采用ＭＰ核酸检
测试剂盒进行扩增检测。以样本曲线与阈值曲线交叉点的坐标读数（监测时间，即ｄｔ）为参数进行结果判读：
ｄｔ≤３５ｍｉｎ为阳性。
  ３．２　ＭＰ血清抗体（ＭＰ Ａｂ）检测　血清样本按日本富士瑞必欧株式会赛乐迪亚 麦可Ⅱ试剂盒说明书进行检测。血清倍比稀释后，分别加入未致敏粒子和致敏粒子，置室温３ｈ观察结果。
  ３．３　七项呼吸道病毒抗原检测法（以下简称“病毒抗原检测”）　该方法可检测４种病毒的７种亚型，包括呼吸道合胞病毒（ＨＲＳＶ）、流感病毒（ＩＶＡ、Ｂ）、副流感病毒（ＨＰＩＶ１、２、３）、腺病毒（ＨＡＤＶ）。具体步骤：振荡咽拭子储存管加入ＰＢＳ制成细胞悬液，并加入到载玻片的孔内，风干后将其浸没在冷丙酮溶液固定并再次风干。每个细胞孔滴加２５μＬ相应的荧光抗体，在３７℃湿盒中孵育、封片，在荧光显微镜下观察结果。荧光素标记的单克隆抗体与病毒抗原结合，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光：呈苹果绿荧光的细胞为阳性细胞，被Ｅｖａｎｓ蓝染成红的细胞为阴性细胞。在２００倍荧光显微镜下，每视野≥２个阳性细胞，判为阳性标本。  ３．４　呼吸道病原体多重核酸检测试剂盒检测（以下简称“病原体核酸检测”）　本研究所采用的呼吸道病原体多重检测试剂盒（ＰＣＲ毛细电泳片段分析法），为宁波海尔施基因科技有限公司生产，包含呼吸道合胞病毒（ＨＲＳＶ）、甲型流感病毒（ＩｎｆＡ）、副流感病毒（ＨＰＩＶ）、乙型流感病毒（ＩｎｆＢ）、腺病毒
（ＨＡＤＶ）、博卡病毒（Ｂｏｃａ）、鼻病毒（ＨＲＶ）、冠状病毒（ＨＣＯＶ）、偏肺病毒（ＨＭＰＶ）、肺炎支原体（ＭＰ）和衣原体（Ｃｈ）。其中ＨＲＳＶ、ＨＰＩＶ、ＨＡＤＶ和甲型流感病毒Ｈ１Ｎ１（２００９）（即病毒抗原检测中的流感病毒ＩＶＡ）分别对应病毒抗原检测方法中的４种病毒。
  具体操作：将采集的痰液或支气管灌洗液样本进行预处理后，在全自动核酸提取仪上提取核酸。核酸样本与ＲｅｓＰ预混液（特异性引物、ｄＮＴＰｓ、镁离子、缓冲成分等）和ＲＴ ＰＣＲ酶液混合进行ＲＴ ＰＣＲ扩增。扩增产物在基因分析仪上进行毛细管电泳分离和结果分析：扩增产物中目的位点峰高度①高于该道毛细管标准品高峰的，判该位点阳性；②低于该道毛细管标准品低峰的，判该位点阴性；③高于该道毛细管标准品低峰、但低于标准品高峰的，判该位点灰区；重新提取核酸并扩增电泳后，仍落在灰区的判阳性、落在阳性区域的判阳性、落在阴性区域的判阴性。
  ４　统计学处理
  采用ＳＰＳＳ１７．０软件进行统计分析。以ＭＰ Ａｂ和ＭＰ ＳＡＴ为金标准，计算病原体核酸检测方法诊断ＭＰ的灵敏度、特异性等准确性参数；以七项呼吸道病毒抗原检测法为金标准，计算病原体核酸检测方法诊断病毒的灵敏度、特异性等准确性参数。计数资料采用例数和百分比表示，检出率比较采用相关样本的配对χ２检验；计量资料采用均数±标准差表示。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结  果
  １　一般情况
  共计纳入３５４例ＣＡＰ住院患儿，其中男孩２１１例（５９．６％），女孩１４３例（４０．４％），年龄０．３～６．０岁，中位年龄１．０岁。最终根据临床诊断和实验室检测结果，１５５例为ＭＰＰ，１５８例为病毒性肺炎，４１例细菌性肺炎。
  ２　病原体核酸检测在ＭＰ感染诊断中的准确性
  １５５例ＭＰＰ组患儿采用病原体核酸检测方法，１５２例（９８．１％，１５２／１５５）为ＭＰ阳性，即灵敏度为９８．１％；以病毒性肺炎和细菌性肺炎患儿为非ＭＰＰ对照组，病原体核酸检测结果显示ＭＰ阳性４例（２．０％，４／１９９），特异性为９８．０％。
  ３　病原体核酸检测在病毒性肺炎诊断中的准确性
  ３．１　病原体核酸检测的灵敏度和特异性　１５８例病毒性肺炎患儿中，采用病原体核酸检测方法，１４１例病毒检测阳性，灵敏度为８９．２％（１４１／１５８）。检出的病毒以ＨＲＳＶ病毒最多（７２．３％，１０２／１４１），其次为ＨＲＶ（１９．９％，２８／１４１）。以ＭＰＰ和细菌性肺炎患儿为非病毒性肺炎对照组，１９６例患儿病原体核酸检测检出病毒３９例（１９．９％，３９
／１９６），特异性为８０．１％；３９例病毒阳性患儿中，３２例所检出的病毒为Ｂｏｃａ５例、ＨＲＶ２４例、ＨＭＰＶ３例；另外７例为病毒抗原所涵盖的病毒类型，包括ＨＲＳＶ１例、ＨＰＩＶ３例、ＨＡＤＶ３例。病原体核酸检测病毒病原的约登指数为０．６９，Ｋａｐｐａ值为０．６８。
表１　在病毒性肺炎组评价１３种呼吸道病原体多重核酸检测方法
组别多重核酸检测
（＋）（－）
灵敏度
（％）
特异性
（％）
阳性预测值
（％）
阴性预测值
（％）
阳性似然比阴性似然比
病毒性肺炎（ｎ＝１５８）１４１１７８９．２１０．８７８．３９０．２４．４８０．１３非病毒性肺炎（ｎ＝１９６）３９１５７１９．９８０．１
  ３．２　病原体核酸检测与病毒抗原检测的一致性　１５８例病毒性肺炎患儿中９９份标本其病原体核酸检测结果与病毒抗原检测结果完全一致，占６２．７％（９９／１５８）。５９例结果不一致，占３７．３％（５９／１５８），其中５８例病毒抗原检测为单一感染，其中①１１例病毒核酸检测也为单一感染，但检出病毒不同；②３０例病毒核酸检测为混合感染，其中５例检出了ＨＲＳＶ或ＨＰＩＶ或ＡＤＶ的混合感染，２５例检出了病毒抗原检测方法所不涵盖的其他病毒感染（２０例检出了ＨＲＶ与其他病毒的混合感染，４例为Ｂｏｃａ与ＨＲＳＶ的混合感染，１例ＨＡＤＶ和ＨＭＰＶ混合感染）；③１７例病原体核酸检测为病毒阴性。１例病毒抗原检测为ＨＲＳＶ和ＨＰＩＶ混合感染，而病毒核酸检测为ＨＲＳＶ和ＨＲＶ混合感染。
表２　５９例肺炎标本抗原检测与核酸检测结果不一致
项目抗原检测核酸检测
１１例抗原检测与核酸检测均为单一感染ｎ＝１ＨＲＳＶＨＭＰＶ
ｎ＝１ＨＲＳＶＩＮＦＡ／０９Ｈ１
ｎ＝２ＨＲＳＶＨＲＶ
ｎ＝７ＨＲＳＶＨＰＩＶ
３０抗原检测为单一感染，核酸检测为混合感染ｎ＝１ＨＰＩＶＨＲＳＶ／ＨＰＩＶ
ｎ＝１ＨＰＩＶＨＰＩＶ／ＨＡＤＶ
ｎ＝３ＨＲＳＶＨＲＳＶ／ＨＡＤＶ
ｎ＝１ＨＰＩＶＨＲＶ／Ｂｏｃａ
ｎ＝１ＨＲＳＶＨＲＶ／ＨＭＰＶ／ＨＰＩＶ
ｎ＝１ＨＰＩＶＨＲＶ／Ｂｏｃａ／ＨＭＰＶ／ＨＲＳＶ
ｎ＝３ＨＰＩＶＨＲＶ／ＨＰＩＶ
ｎ＝１４ＨＲＳＶＨＲＶ／ＨＲＳＶ
ｎ＝４ＨＲＳＶＢｏｃａ／ＨＲＳＶ
ｎ＝１ＨＡＤＶＨＡＤＶ／ＨＭＰＶ
１７例抗原检测为单一感染，核酸检测为阴性ｎ＝２ＨＰＩＶ（－）
ｎ＝１５ＨＲＳＶ（－）
１例抗原检测与核酸检测均为混合感染ｎ＝１ＨＲＳＶ／ＨＰＩＶＨＲＳＶ／ＨＲＶ
讨  论
  随着呼吸道病原体核酸检测方法的迅速发展，呼吸道病原体的检测技术逐渐优化和整合，为临床诊断和呼吸系统疾病提供了强有力的依据。目前已有一系列的病原体高通量检测技术应用于临床检测中。本文所采用的呼吸道病原体多重核酸检测方法，采用多重ＲＴ ＰＣＲ与毛细管电泳联用技术，可实现呼吸道病原体的多重定量检测，为具有我国自主研发、具有自主知识产权的检测试剂盒。该试剂盒以
病毒病原为主，同时检测ＭＰ和Ｃｈ，因此本文评价了该试剂盒在病毒性肺炎和ＭＰＰ中的诊断准确性，以期为临床的实验室诊断提供证据。
  病毒感染是儿童肺炎的重要病原，近年来临床医生越来越重视儿童呼吸道病毒感染的检测，在呼吸道感染急性期需明确诊断细菌感染或病毒感染，可避免抗生素的过度使用，故病毒病原检测变得更为重要［５］。在本研究中，１５８例病毒性肺炎患儿，病原体核酸检测出１４１例阳性，灵敏度为８９．２％。此外在临床实际检测中，１５５例ＭＰ Ａｂ和ＭＰ ＳＡＴ阳性和４１例细菌检测阳性，共计１９６例患儿临床分别诊断ＭＰＰ和细菌性肺炎，其病毒抗原检测均为阴性，但是通过病原体高通量检测技术仍然检出了３９例病毒核酸阳性。由于该技术增加了更多的病毒类型，因此检测出的阳性病例主要为病毒抗原检测未涵盖的ＨＲＶ病毒等。呼吸道病原体多重核酸检测方法与呼吸道抗原检测结果完全一致的比率较低，不一致的结果占到了３７．３％，两方法不一致的原因主要是呼吸道病原体多重核酸检测可以测出更多的合并感染，以及呼吸道病毒抗原检测以外的病原体，大幅缩短了检验周期，实现了一份标本同时检测多种病原体。高通量检测有助于提高病毒的检出率，减少漏诊的可能。尤其是近年来，随着新发病毒的逐渐出现，重症混合病毒感染病例的增多，采用多病毒组合有助于及早辅助临床诊断。本课题组前期马慧轩等［６］对我院收治同时进行了呼吸道病毒抗原检
测、细菌培养和ＭＰ Ａｂ检测的１８５３例ＣＡＰ患儿的病原谱的分析发现，其中仅有７８．１％的患儿检出了明确的病原体，仍有２１．９％患儿在出院时仍未到明确的病原体感染证据。也就意味着，
通过上述传统的培养和血清学方法仍无法检出所有的病原体，仍存在病原学未检出的可能。
  病原体核酸检测已经逐渐被作为呼吸道感染性疾病的确诊证据。近年来一系列病毒核酸高通量检测技术逐渐应用于成人和儿童ＣＡＰ的诊断。ＨＵＧＵＥＮＩＮ等［７］采用一种包含１７种呼吸道病毒型别／亚型的基因芯片，对１３８例支气管炎住院婴儿的鼻咽抽提物标本进行检测，结果１２６例患儿检测阳性，其中单一感染４４例（３３％），混合感染８５例（６７％），该方法在８ｈ内获得了准确的结果。我们课题组王咏红等［８］采用该试剂盒对下呼吸道感染住院患儿的检测结果显示，恒温扩增芯片法检出的阳性率为７９．１％，且大部分患儿为混合感染，该方法针对细菌病原体的检出率也远高于传统的细菌培养法。由此可见，高通量病原检测方法有助于临床医生在短时间内准确获取病原体感染证据，甚至可以对未知的新发病原体进行筛选，具有很好的应用前景。
  ＭＰ是儿童急性呼吸道感染的常见病原体，近年来ＭＰＰ的发病率呈增高趋势。因其临床表现无特异性，易与细菌性和病毒性肺炎混淆，故早期的实验室检测对临床诊治具有重要意义［９］。血清学检测方法在疾病早期或接受免疫抑制的患儿中易发生漏诊，而ＰＣＲ直接检测病原体核酸水平，灵敏度、特异性及阳性检出率均高于血清学检测［１０］。本研究中，病原体高通量检测技术对ＭＰ的检测结果，与血清ＭＰ Ａｂ和ＭＰ ＳＡＴ比较，具有非常高的灵敏度（９８．１％）和特异性（９８．０％），提示该方法对ＭＰＰ诊断也具有很好的准确性。
  此外，相对于传统检测方法，病原体核酸检测技术的优势除了高通量，还包括：第一，最大程度的节省了样本量。儿童咳痰反射弱，难以取到合格的痰液标本，且样本体积小，采用传统的检测方法时，无法同时进行多种病原的检测。呼吸道病原体多重核酸检测试剂盒采用多重ＲＴ ＰＣＲ与毛细管电泳联用技术，克服了常规ＰＣＲ检测阳性率低的不足，它通过自动核酸提取仪提取核酸，降低了样品用量，增加了检测的灵敏度，减少污染。第二，以病原体的高度保守序列为靶区域，采用病原体的特异性引物进行扩增；通过对样品中的人ＲＮＡ和人ＤＮＡ进行检测，对样品质量进行监控；同时利用ＲＴ ＰＣＲ内参用于对核酸提取、ＲＴ ＰＣＲ和毛细电泳等整个检测过程进行监控，保证了检测的准确性。第三，通过多病原体的同时检出，降低了检测的成本，减少了患儿的经济负担。但是，在本研究中，病毒性肺炎患儿中１７例（１０．８％）未检出病毒核酸，提示该方法也存在一定的假阴性结果。此时，临床应结合患儿的实际情况进行综合判断。
  综上所述，呼吸道病原体多重核酸检测试剂盒在ＭＰＰ的诊断中，灵敏度和特异性较高；与传统的病毒抗原检测相比，具有高通量检测的优势，可同时完成更多种病毒类型的检出；具有快速、灵敏度高等特点，可以为儿童呼吸道病原体的诊断以及鉴别诊断提供很好的证据。
参考文献
［１］ＪＡＩＮＳ，ＷＩＬＬＩＡＭＳＤＪ，ＡＲＮＯＬＤＳＲ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃ
ｑｕｉｒｅｄｐｎｅｕｍｏｎｉａｒｅｑｕｉｒｉｎｇｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎａｍｏｎｇＵ．Ｓ．ｃｈｉｌｄｒｅｎ［Ｊ］．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，２０１５，３７２（９）：８３５ ８４５．
［２］ＧＢＤ２０１５ＬＲＩＣｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．Ｅｓｔｉｍａｔｅｓｏｆｔｈｅｇｌｏｂａｌ，ｒｅｇｉｏｎａｌ，ａｎｄｎａｔｉｏｎａｌｍｏｒｂｉｄｉｔｙ，ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，ａｎｄａｅｔｉｏｌｏｇｉｅｓｏｆｌｏｗｅｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｔｒａｃｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎ１９５ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｔｈｅｇｌｏｂａｌｂｕｒｄｅｎｏｆｄｉｓｅａｓｅｓｔｕｄｙ２０１５［Ｊ］．ＬａｎｃｅｔＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，２０１７，１７（１１）：１１３３ １１６１．
［３］江载芳，申昆玲，沈颖．诸福棠实用儿科学［Ｍ］．第８版．北京：人民卫生出版社，２０１５：３ ４．
［４］中华医学会儿科学分会呼吸学组，《中华儿科杂志》编辑委员会．儿童社区获得性肺炎管理指南（２０１３修订上）［Ｊ］．中华儿
科杂志，２０１３，５１（１０）：７４５ ７５２．
［５］中国医师协会儿科医师分会儿童耳鼻咽喉专业委员会．儿童反复上呼吸道感染临床诊治管理专家共识［Ｊ］．中国实用儿科杂
志，２０１７，３２（１０）：７２１ ７２５．
［６］马慧轩，孙琳，吴喜蓉，等．北京单中心社区获得性肺炎住院患儿病原学分析［Ｊ］．中国循证儿科杂志，２０１５，１０（５）：３６１ ３６５．［７］ＨＵＧＵＥＮＩＮＡ，ＭＯＵＴＴＥＬ，ＲＥＮＯＩＳＦ，ｅｔａｌ．ＢｒｏａｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｉｎｆａｎｔｓｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄｆｏｅｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓｂｙｕｓｅｏｆａｍｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ ＰＣＲＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＪＭｅｄＶｉｒｏｌ，２０１２，８４（６）：９７９ ９８５．
［８］王咏红，郭雅洁，陈玉莹，等．恒温扩增芯片法在儿童下呼吸道感染性疾病中的应用价值评估［Ｊ］．中国循证儿科杂志，２０１８，１３（３）：１７６ １７９．
［９］秦小菀，朱萍，惠晓霞，等．ＰＣＴ与ＣＲＰ和ＷＢＣ及前白蛋白联合检测对儿科感染性疾病早期诊断的价值［Ｊ］．中华医院感染学
杂志，２０１９，２９（１）：１４６ １４８，１５６．
［１０］ＬＩＪ，ＳＵＮＬ，ＷＵＸ，ｅｔａｌ．Ｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎ：ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎａｎｄｔｅｓｔｉｎｇ（ＳＡＴ）ｉｓｔｈｅｋｅｙ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＰｅｄｉａｔｒ，２０１９，７：４４１．

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。