DOI:10.13602/j.cnki.jcls.2020.11.10
㊃新型冠状病毒肺炎㊃
基于大规模人新型冠状病毒核酸检测的经验介绍
㊀㊀㊀㊀通信作者:薛娴,研究实习员,硕士,南京医科大学第二附属医院医学遗传科,E⁃mail:xianxue@njmu.edu.cn㊂
江苏省援疆核酸检测医疗队
摘要:根据国家新型冠状病毒肺炎(COVID⁃19)疫情防治工作需要,为全力支援新疆新型冠状病毒(2019⁃nCoV)核酸检测工作,2020年7月17日江苏省紧急组建了第一批省核酸检测医疗队驰援新疆㊂该文总结第一批核酸检测队在新疆2019⁃nCoV核酸检测工作的经验,为未来可能出现的COVID⁃19或其他突发公共卫生事件的大规模人筛查工作提供参考㊂关键词:新型冠状病毒;核酸检测;大规模筛查中图分类号:R446㊀㊀㊀㊀文献标志码:A
㊀㊀根据新型冠状病毒肺炎(COVID⁃19)疫情防治工作需要,为全力支援新疆新型冠状病毒(2019⁃nCoV)筛查工作,
2020年7月17日江苏省卫生健康委员会迅速响应国务院应对COVID⁃19联防联控机制统一部署,紧急抽调21名分子检验领域的精英人员组建江苏省检验医疗队驰援新疆㊂7月18日第一批检测队随行携带全套仪器设备及耗材(8台核酸提取仪和6台荧光PCR仪等72件)㊁检测试剂(2.4万人份)和各类防护物资,奔赴新疆㊂该文以实时荧光RT⁃PCR法为技术平台,总结在新疆2019⁃nCoV筛查核酸检测工作中的经验,为未来可能出现的COVID⁃19或其他突发公共卫生事件的大规模人筛查核酸检测提供参考㊂1㊀实验室建设
㊀㊀由于新疆当地医院不能提供标准化PCR实验室,根据工作流程和生物安全要求,首先对院方提供的场地进行改造㊂以实时荧光RT⁃PCR法为技术平台,实验室需单一走向
的专用走廊,并划分3个操作区:试剂准备区(Ⅰ区)㊁样本制备区(Ⅱ区)㊁扩增检测区(Ⅲ区),每个区均设置缓冲间(图
1)㊂缓冲间进深至少1.5m,可用于检测人员脱防护用品等㊂标本先送至Ⅱ区缓冲间,再进入Ⅱ区㊂在常规3个操作区的基础上增设1个实验前区(准备区),用于耗材防护物资存放及工作人员穿戴三级防护用品㊁提取试剂及耗材带入Ⅱ区前的拆包等㊂Ⅰ区㊁Ⅱ区㊁Ⅲ区房间的面积分别至少为10m2㊁40m2㊁40m2㊂各区常压,每区之间通过传递窗传递物品㊂Ⅱ区和Ⅲ区外墙装1 2个强力换气扇㊂各区移动紫外车1 3台㊂每个分区都有明确的标识,并且每个分区内的区域㊁仪器设备等标识清晰㊂
在实验室的改造过程中,有几点值得注意,因各区常压,尽量选择通风良好的房间,根据单一流向的要求开门封门㊁安装传递窗,根据各区面积配备移动紫外线车㊂三区根据扩增仪的数量安装相应制冷设备,如空调或冷气扇
:走廊走向
;传递窗;门
;封闭
;窗户
图1㊀PCR实验室改造示意图
1.1㊀主要仪器设备㊀试剂准备区(Ⅰ区):超净工作台1 2台,5 50μL可调8通道移液器1把,
单通道移液器组合(1 10μL㊁5 50μL㊁10 200μL㊁200 1000μL)1套,移液器架㊁振荡器㊁掌式离心机各1台,冰柜1 2台(-20ħ,存放扩增试剂),可移动紫外车2台等㊂样本制备区(Ⅱ区):生物安全
柜2 3台,96孔全自动核酸提取仪,5 50μL可调8通道移液器1把,200 1000μL单通道移液器4把,移液器架3个,振荡器2个,8联管及96孔板掌式离心机各1台,台式高速冷冻离心机㊁恒温设备如金属浴1个或孵箱㊁展示柜(4 8ħ)2台㊁冰柜(-20ħ)1台㊁可移动紫外车2台㊁洗眼器㊂
838㊃临床检验杂志2020年11月第38卷第11期㊀ChinJClinLabSci,Nov.2020,Vol.38,No.11
扩增检测区(Ⅲ区):实时荧光定量PCR仪㊁电脑㊁UPS电源㊁可移动紫外车2台等㊂
核酸检测结果阳性参考值阴性1.2㊀仪器配量㊀我队由21名队员组成,实际工作中运行4台提取仪(96孔,全自动),8台实时荧光定量PCR仪,即1台提取仪配比2台PCR仪,这个配比可在保证扩增仪轮休的情况下,达到最大检测能力(每台扩增仪日最大检测能力为1000管)㊂
1.3㊀试剂及其他设备㊁耗材
试剂:使用原装配套的提取试剂和扩增试剂,复检试剂为另一品牌扩增试剂㊂
其他设备:对讲机4 5个,75%酒精,大中小黄医疗垃圾袋(大量),大小黄医疗垃圾桶各8 10个,锐器盒(大量),酒精喷壶10 20个,穿衣镜2个,洗手衣(手术服)(每人ȡ2套),含氯消毒片,高压蒸汽灭菌器2个㊂
耗材:大量加长型带滤芯无核酸酶头(10μL㊁50μL㊁200μL㊁1000μL)㊁配液槽㊁8连管㊁96孔板及配套封膜,封口袋等㊂
试剂耗材的补给:由当地医院提供㊂
2㊀生物安全防护
㊀㊀新冠病毒核酸检测是一项风险较高的操作,生物安全防护极为重要㊂根据实验室分区的功能不同及其风险程度,选择合适的个人防护物品保护检测人员安全㊂Ⅰ区和Ⅲ区的人员采取二级生物安全防护,Ⅱ区人员采取三级生物安全防护㊂抵达当地医院后,由院方院感科工作人员首先对我队全体队员进行三级生物安全防护的再培训,尤其是防护服的穿脱,并现场进行考核,所有队员均合格㊂
3㊀实验流程
3.1㊀标本交接流程㊀标本首先送到当地医院的检验科,由检验科核对信息并重新编号,按1 90㊁101 190㊁201 290  的编号规则进行编号㊂标本的编号以一个自然日为周期,当日标本全部清零,次日再重新开始编号㊂检验科将已编号样本送至我队实验室,并进行交接登记㊂Ⅱ区队员收到样本后,首先核对样本编号,确认无误后进入检测流程㊂由于大规模筛查样本量非常大,并且一旦发现异常标本,需要迅速且准确无误地在几千标本中出该样本,进入复检和上报程序,这就需要样本的唯一编号清晰且适合抓取,这种编号方式不但方便流程记录表书写(表1),而且也便于Ⅱ㊁Ⅲ区实验人员及时准确地沟通㊂
3.2㊀检测流程㊀每组队员提前到达实验室,进行实验前的准备工作,根据工作量在实验前区拆取提取试剂及头盒外包装,一方面可提高在Ⅱ区的工作效率,为标本检测争取更多的时间;另一方面大量减少需高压灭菌的医疗废物,降低消毒压力㊂根据分工,穿戴相应防护用品,2名队员穿戴好二级防护后,1人迅速进入Ⅲ区判读并发布前一组交班的结果,1人进入Ⅰ区配试剂㊂其余队员穿戴好三级防护,携带所需耗材进入Ⅱ区工作㊂Ⅰ区队员完成本组所需试剂的配制后更换三级防护进入Ⅱ区参与样本提取工作,形成 Ⅱ区4人㊁Ⅲ区1人 的工作模式㊂考虑到不同实验室的人员储备㊁提取仪数量等,建议每检测组最少5人,Ⅰ区㊁Ⅱ区及Ⅲ区人员配比最好是按1ʒ4ʒ1来安排㊂
表1㊀上机检测样本编号记录表
123456789101112A010917253341495765738189B021018263442505866748290C0311192735435159677583
D0412202836445260687684阴性E0513212937455361697785环评1F0614223038465462707886环评2G0715233139475563717987
H0816243240485664728088阳性㊀㊀注:从第1列开始编号,A H行分别为01 08号样本,第2列A H行分别为09 16号样本,后面依次类推;第12列空着的2个孔位,为异常结果标本复检孔;阴性,阴性对照;阳性,阳性对照;环评1,环境评价1;环评2,环境评价2㊂
㊀㊀Ⅱ区队员在提取时,标本号及提取板的编号要一一对应,每次提取结束后用75%酒精擦拭提取仪内部,并至少10min的紫外灯照射㊂每板结果判读后,Ⅲ区通过对讲机及时将异常结果标本信息反馈至Ⅱ区,以便异常结果标本第一时间复查,并及时清理阴性标本,当班未能复查的异常结果样本及其提取液暂存于Ⅱ区冷藏柜,并标注日期等信息,同时做好交接班记录㊂Ⅱ区人员结束工作后,用75%酒精擦拭生物安全柜㊁台面及提取仪的内外表面,打包带走所有医疗垃圾,开启紫外灯消毒并开窗通风㊂Ⅲ区人员在每板扩增结束后,关闭PCR仪电源,上报结果并用75%酒精擦拭PCR仪内部,空置
30min后再使用,以保证PCR仪的可持续运行㊂为保证标本的可溯源性,每个分区都有对应的流程表,并要求填写完整,不能有空项㊂要有风险意识,随手关门㊂3.3㊀结果上报及复检原则㊀每板结果出来后,Ⅲ区队员首先参考扩增试剂说明书判断阴性对照㊁环境评价和阳性对照是否在控,若失控需立即查原因,并整改㊂在阴性对照㊁环境评价和阳性对照均在控的情况下进行结果分析,若有内参未检出的标本,立即原管复检;若出现ORF1ab或N基因单靶位点阳性则不上报,立即使用双试剂复检;若ORF1ab及N基因双靶位点阳性第一时间上报,同时立即双试剂复检㊂在记录流程表时,填写复检标本的孔位,初始Ct值及复检Ct值,并做好交接班记录㊂
3.4㊀意外事件/事故处理流程
3.4.1㊀标本溢洒的处理流程㊀当出现标本溢洒时,首先在溢洒区域铺上纱布(完全覆盖),而后用5000mg/L的含氯消毒液喷洒在纱布上,作用30min以上,再将纱布小心移除㊂清理过程中避免接触污染物,清理的污染物按感染性废物处置㊂清除污染物后,用1000mg/L的含氯消毒液喷洒物体表面,最后开紫外灯进行消毒㊂
3.4.2㊀实验室环境的消毒流程㊀当进行实验室环境消毒时,首先用1000mg/L含氯消毒液擦拭物体表面㊁地面以及提取仪㊁PCR仪㊁生物安全柜㊁超净台等的内部,之后用75%乙醇进行重复擦拭消毒,最后开紫外灯进行消毒㊂
4㊀人员
㊀㊀领队1人㊁队长1人㊁秘书1人,检测人员最少需18 20人,每名队员均具备PCR资质并熟练掌握核酸提取㊁核酸扩增技术和生物安全防护技能,每队至少1人具有特种设备从业人员资质㊂检测队员分组,若分3组,每组6人,每班工作
6h;若分4组,每组5人,每班工作5h㊂同时,根据工作量及标本送达时间,随时调整班次,尽可能保证队员休息,保证持续战斗能力㊂
注意队员健康监测,每天2次体温测量,每周做1次核酸检测㊂加强队员心理疏导,通过开展党组织生活会及小组交流㊁谈心等多种方式,舒缓队员压力,使队员保持积极乐观的心态,避免出现焦虑情绪和抑郁状态,并时刻保持良好的自我防护意识㊂
检测医疗队返程后,队员采取居家隔离㊂居家隔离时应选择家庭中通风较好的房间隔离,每天上午和下午各测量1次体温,并尽可能减少与其他家庭成员接触等[1]㊂
5㊀混采而不混检
㊀㊀对于口咽拭子的采集,可混采不可混检,以确保结果的准确性和可靠性[2]㊂援疆期间,混采标本从5合1到一家人合1,最大量到10合1㊂混检本身是一个稀释的过程,在检测方法的检出限相同
的情况下,很容易漏检病毒载量较低的阳性标本,而混采则极大地降低了漏检率㊂而我队在援疆期间就遇到因标本稀释差点漏检的情况,有1例标本5ʒ1混采检测出强阳性(双靶点Ct值均为27),但5个单采的标本因其他单位检测后稀释2倍送至我队实验室,3种品牌的扩增试剂㊁3台不同的PCR仪重复做,只有一次实验检测出N基因且Ct值为38.3,其余均未检出㊂
6㊀小结与展望
㊀㊀在援疆期间,为应对大批量检测需要,缩短报告时间,完成防控指挥部下派的检测任务,我队多次梳理和优化了检测流程以及交接班规定等,强调操作规范化㊁标准化,高效率㊁高质量地完成了核酸检测任务㊂疫情就是命令,防控就是责任,实验室就是战场㊂战时状态,最讲究时效性,第一时间抓住异常病例,第一时间双试剂复查,第一时间报告,以便做到第一时间隔离㊂
总结我队本次援疆之行经验,概括为3点:(1)各类标识标志明确,实验室有明确分区,每个分区内也有明确标识;(2)流程标准规范,完整准确的流程表可保证样本结果的可溯源性,这对于在大规模筛查中准确到异常样本至关重要;(3)技术能力过硬,我队队员既是检测人员,也是仪器工程师㊂援疆期间,在仪器工程师无法到场支援的情况下,能够迅速地发现并自行解决遇到的各种问题,保证仪器高效运转㊂同时,自治区政府和当地医院在生活㊁交通㊁试剂保障等各方面均给予了大力支持㊂所有人共同努力,克服各种困难,完成了艰巨的核酸检测任务,甚至创造了单日检测量
8405管的纪录㊂
对于COVID⁃19患者早发现㊁早报告和早隔离,是控制疫情传播的首要任务㊂而快速有效的2019⁃nCoV实验室检测则显得非常迫切,这对实验室人员提出了更高的要求,要做好生物安全防护工作,严格按照标准操作规程实施2019⁃nCoV检测工作,做好标本检测的全程质量控制工作,提高病毒检出率,更好地应对未来可能出现的COVID⁃19或其他突发公共卫生事件的大规模人筛查核酸检测㊂执笔:薛娴(南京医科大学第二附属医院),董苏荣(泰州市人民医院),王颖(淮安市第一人民医院)
江苏省援疆核酸检测医疗队名单
许斌(江苏省肿瘤医院㊁江苏省临床检验中心),董苏荣(泰州市人民医院),裴豪(无锡市第五人民医院),束国防(东南大学附属中大医院),薛娴(南京医科大学第二附属医院),王颖(淮安市第一人民医院),赵鸿(江苏省人民医院),孙靖(常州市第一人民医院),李妍(南京医科大学附属逸夫医院),张哲雄(连云港市第二人民医院),熊御云(江苏大学附属医院),陈相(南通市第一人民医院),孙宝兰(南通大学附属医院),宋妙丽(苏州市立医院),余汉忠(徐州市第一人民医院),李颖(徐州医科大学附属医院),罗富银(高邮市人民医院),刘志明(南京市浦口区中心医院),张发(南京市浦口区中心医院),曹风华(镇江市中西医结合医院),邵可可(盐城市第一人民医院)㊂
7㊀参考文献
[1]国家卫生健康委员会办公厅.新型冠状病毒感染的肺炎防控中居家隔离医学观察感染防控指引(试行)[EB/OL].(2020⁃02⁃04).http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2020⁃02/05/content_5474688.htm.
[2]国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组.关于印发新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范的通知[EB/OL].(2020⁃08⁃17).http://www.gov.cn/xinwen/2020⁃08/19/con⁃tent_5535756.htm.
(收稿日期:2020⁃09⁃27)
(本文编辑:刘)

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