Doi ： 10. 13621 /j. 1001 - 5949. 2020. 10. 0913
-实验研究-
不同新型冠状病毒核酸检测试剂性能比较分析
张伟宏马 雯*
2，李富荣2，葸 静3，金哲宇2叭崔学强2，何瑞芬2，张俊华2，朴文花2［基金项目］宁夏重点研发计划科技支撑"新型冠状病毒感染的肺
炎疫情防控”专项（2020BEG03023）
［作者单位］1.宁夏银川市疾病预防控制中心，宁夏银川750002
2. 宁夏回族自治区人民医院临床医学检验诊断中心， 宁夏银川750002
3. 宁夏金域医学检验所，宁夏银川750002
4. 苏州大学附属第一医院骨科，江苏苏州215006
［通讯作者］朴文花，Email : ******************
［摘要］目的 比较6种新型冠状病毒核酸检测试剂盒的性能，为相关实验室选择核酸检测试剂提供参
考依据。方法 选择6种国产新型冠状病毒核酸检测试剂盒，比较其基本情况，并用5例阳性患者的咽拭子标 本，提取RNA 倍比稀释后进行RT-qPCR 检测，分析扩增结果，评估各试剂盒的差异。结果 使用核酸检测试剂
盒检测稀释后的RNA ，扩增后可见IC 基因、N 基因及ORF1ab 基因的Ct 值及A Rn 值有显著差异；在1 ：16稀释 倍数时F 试剂未检测到ORF1ab 基因，C 试剂在1 ：64时无法检出ORF1ab 基因和N 基因，A 、B 、D 试剂在1 ：256 稀释倍数时未检测到ORFlab 基因和N 基因，E 试剂在各个稀释度均可扩增IC 、ORF1ab 、N 及E 4个基因。
结论新型冠状病毒核酸检测试剂对低病毒载量核酸的检测能力有较大差异，各实验室选用试剂时需要进行 性能验证，根据检测目的和检测对象选择合适的试剂盒。
［关键词］2019新型冠状病毒；核酸检测；试剂盒；性能比较
［中图分类号］R192.3 ［文献标识码］A
Comparison and analysis oftheperformancein different COVID-19 nucleic acid detection reagents
ZHANG Weihong 1，MA Wen 2, LI Furong 2，XI Jing 3，JIN Zheyu 2'4, CUI Xueqiang 1，HE Ruifen 2，ZHANG Junhua 2，PIA O Wenhua^.
1. The Center for Disease Control and Preventionof Yinchuan ，Yinchuan 750002，China ；
2. The Department of Clinical Medical
Examination and Diagnosis Center ，Ningxia Hui Autonomous Region People's Hospital ，Yinchuan 750002，China ； 3. Ningxia Jinyu Medical Laboratory ，Yinchuan 750002，China ； 4. Department of Orthopedics ，The First Affiliated Hospital of Suzhou University , Suzhou 215006, China
Corresponding author : PIA O Wenhua ，Email ： ******************
［Abstract ］ Objective To compare and analyze the detection ability of six domestic SARS -CoV -2 (Covid-19) detection kits ,thus providing reference for molecular laboratories. Methods Six domestic detection kits ,categorized randomLy from A to F , were selected and applied in the detection of SARS-Cov-2. Five positive nasopharyngeal swab specimens were selected in the study , Ct(threshold cycle )value , ARn value and detection of target genes(ORF1ab ,E and
N gene )and IC gene were analyzed and evaluated prior to and after different dilution folds. Results Ct (threshold cycle )and ARn value for ORF1ab , IC , E , N gene showed statistically significant differences at different dilution folds for six detection kits. At the dilution of 1：16,F kit was unable to detect ORF1ab gene. At the dilution of 1 ：64, C kit was unable to detect ORF1ab and N gene. At a dilution of 1 ：256, A , B and D kits were unable detect ORF1ab and N genes. E kit detected IC , ORF1ab , N and E gene at all dilution folds. Conclusion Detection ability for 6 nucleic acid detection kits varied for low -viral load samples. Performance validation prior selection of kits is recommended. Selection of reagent kits should be based on the aim of the testing and testing subjects.
［Key words ］ SARS-Cov-2； Nucleic acid detection ； Re a ge n t kits ； Performance comparison.
由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的新
型冠状病毒肺炎（COVID-19）在世界范围内迅速蔓
延,RT-qPCR 检测新冠病毒核酸阳性作为诊断疾病 的标准，在疾病的防控中发挥了重要的作用⑴。目前
经批准上市的新冠病毒核酸检测试剂主要针对病毒
基因组中3段保守基因序列，即以开放读码框1ab
（ORF1ab ）、核壳蛋白（N ）基因以及包膜蛋白（E ）基
因作为检测靶标⑵。然而，在临床实际工作中发现，
新冠病毒核酸检测对于阳性患者的阳性率仅为
30%~50%，临床较多的疑似病例需要多次核酸检测 之后才得到阳性结果，使新冠病毒核酸检测作为确
诊标准备受质疑⑶。核酸检测试剂在检测体系中具
有极其重要的作用，基于目前新冠病毒核酸检测中 所出现的问题，本文采用6种国内已注册的新型冠 状病毒核酸检测试剂盒，通过比较其基本情况及实 时荧光定量PCR 扩增结果等参数，为使用者合理选 择试剂提供参考依据。
1材料与方法
1.1标本来源：收集5例新型冠状病毒确诊患者的 咽部拭子作为标本，按照规定采样后立即送往实验 室检测，标本检测前置于65 T 水浴20 min 进行灭活。
1.2 检测试剂：核酸提取选用罗氏MagNA Pure LC total Nucleic Acid Isolation （批号：44502300），扩增选
取6个不同企业生产的新型冠状病毒核酸检测试剂
盒，随机编号为A~F号。A号试剂批号为20200810, B号试剂批号为2020003,C号试剂批号为2020008，D号试剂批号为20200202,E号试剂批号为20200309,F号试剂批号为20200224A。所有试剂盒均批检合格并在有效期内使用。
1.3检测仪器：①安徽嘉文JW-2018H高速冷冻离心机;②Thermo Fisher NanoDrop One紫外/可见分光光度计；③罗氏MP24全自动核酸提取仪；④ABI 7500实时荧光定量PCR仪。
1.4实验室检测
1.4.1RNA提取：总RNA的提取使用罗氏MP24全自动核酸提取仪及其配套核酸提取试剂MagNA Pure LC total Nucleic Acid Isolation(批号：44502300)，严格按照操作流程操作。提取的核酸使用NanoDrop One紫外/可见分光光度计测量核酸浓度及A260/A280比值。
1.4.2核酸扩增：使用ABI7500PCR仪根据不同厂家提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测试剂盒说明书设置荧光检测通道及反应程序，并对检测结果进行阴性、阳性判定。采用1：4,1：16,1：64, 1：25
6倍比稀释核酸，使用6种不同核酸检测试剂进行核酸检测。6种试剂核酸上样量、荧光检测和扩增循环数及结果判断不同，参照各自试剂盒说明书进行检测。
1.4.3质量控制：每批试验均带阴性和阳性对照，阴性和阳性对照检测结果在控，则该批次试验有效，反之无效。
1.5安全与防护：实验人员严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)的通知》⑸及《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)》⑷相关文件进行实验操作和生物安全防护。
1.6统计学方法：数据分析使用SPSS2
2.0软件，核酸经稀释后的扩增数据使用重复测量的多元方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。图表使用GraphPad Prism&0.2软件进行绘制。2结果
2.1核酸检测试剂盒基本情况的比较：6种新冠病毒核酸检测试剂盒的基本情况见表1。各试剂均使用IC基因作为内部检测对照，其中D试剂仅检测1个ORF1ab靶基因，E试剂检测ORF1ab、N、E3个靶基因，其余4个试剂检测ORF1ab、N2个靶基因。核酸起始加入量最少是C试剂仅为2以，最大量B 试剂为20M，D试剂为10以，其他3个为5以。扩增循环数C、D、F试剂为40个，而A、B、E试剂为45个。扩增
总用时A试剂最长为115min，其次为B试剂105min,C为98min，其他3个试剂在80min左右。结果判断A和B试剂Ct值=£40,D和F试剂W 38,C试剂£37，而E试剂£43。试剂的灵敏度最小为D试剂仅为100Copies/mL,B试剂为200Copies/mL, A、C试剂为500Copies/mL，E、F试剂为1000Copies/mL。RT-PCR具体条件也各自不相同，见表1。
表16种不同新冠病毒核酸检测试剂盒基本情况比较
检测
试剂
检■测
基因
扩增体系核
酸上样量(pl)
扩增
循环数
检测(用时
(min)
阳性结果
判断值
最低检测限
(Copies/mL)
A ORFlab、N、IC545115£40500
B ORFlab、N、IC2045105£40200
C ORF1ab、N、IC24098£37500
D ORF1ab、IC104086£38100
E ORF1ab.N v E.IC54582£431000
F ORF1ab、N、IC54085£381000
2.2扩增结果的比较：对5例确诊患者的咽拭子标本进行核酸提取，其总RNA经检测核酸浓度为(47.480±9.890)ng/M,A260/A280为(1.924±0.305)ng/^l，核酸质量及纯度符合实验要求。使用洗脱液按照1：4、1：16、1：64、1：256稀释提取出的5份样本的总RNA,6种试剂盒平行操作，RT-qPCR扩增新型冠状病毒的相关基因。各基因检测结果的Ct值见表2。E试剂在各个稀释度均可检出ORF1ab、N、E、IC 基因。A、B试剂不检测E基因，在1：256稀释时无法检出ORF1ab、N基因；D试剂不检测E基因和N基因，在1：256稀释时无法检测出ORF1ab基因。C试剂在1：64时无法检测ORF1ab、N基因；F试剂不检
表2不同稀释度时各试剂检测结果的Ct值(X±s)
稀释度厂家ORF1ab Gene N Gene IC Gene E Gene厂家ORF1ab Gene N Gene IC Gene E Gene 1：1A30.465±0.16134.320±0.04225.434±0.071无D32.502±0.072无21.502±0.0339无1：432.644±0.62736.355±0.35727.496±0.053无34.274±0.113无22.621±0.205无1：1635.472±0.62939.418±0.83929.798±0.056无36.316±0.516无25.251±0.617无1：6438.720±0.84340.833±0.71332.032±0.070无38.500±1.981无27.139±0.192无1：256未检出未检出34.
861±0.381无未检出无29.746±0.219无
稀释度厂家ORF1ab Gene N Gene IC Gene E Gene厂家ORF1ab Gene N Gene IC Gene E Gene 1:1B32.489+0.60029.870+0.40123.928+0.190无E31.566+0.09432.661+0.01726.575+0.12331.390+0.003 1：435.527+0.31532.781+0.18025.268+0.097无33.745+0.24134.269+0.11926.845+0.10333.421+0.245 1：1637.849+0.18534.984+0.53327.513+0.088无35.813+0.40336.478+0.47226.866+0.08535.530+0.510 1：6440.750+0.48637.489+1.08429.816+0.133无38.522+0.65139.297+0.63227.007+0.15938.457+0.561 1：256未检出未检出32.558+0.144无38.588+0.35139.307+0.45726.977+0.18538.259+0.646 1：1C30.465+0.10630.600+0.04520.575+0.062无F34.571+0.63232.253+0.35924.461+0.164无1：432.644+0.62732.121+0.15222.460+0.228无35.996+0.33533.958+0.27526.557+0.113无1：1635.472+0.62933.683+0.18324.834+0.024无未检出35.820+0.47428.753+0.107无1：64未检出未检出27.109+0.121无未检出37.471+0.93130.882+0.072无1：256未检出未检出29.699+0.094无未检出未检出33.111+0.199无
测N基因，自1：16之后即无法检出ORFlab基因, 1：256时无法检岀N基因。各试剂盒相比较差异无统计学意义（P>0.05）。
不同试剂检测时IC基因、N基因、ORF1ab基因的Ct值及△Rn值变化，可见随着稀释倍数的增加，各基因的Ct值随之增加，其中E试剂使用外标形式检测IC基因，所以IC基因的Ct值未出现增加的趋势。稀释倍数增加后总RNA浓度下降，扩增后ORF1ab 和N基因的A Rn值显著降低，在1：256稀释时明显
降低。
3讨论
核酸检测具有早期、敏感、特异性高、易操作等优势，但对于核酸检测结果的准确性，需要从样本类型、质量、实验因素、试剂盒性能及患者感染周期等影响因素来综合分析[7-8]，尤其针对疑难病例应当更加严格地控制检测的准确性。本研究分析比较了6种国产新型冠状病毒核酸检测试剂对阳性新冠肺炎患者标本检测的结果，发现6种试剂盒的检测能力差异明显。其中E试剂检测能力较好，在各稀释度对SARS-CoV-2（ORF1ab基因、N基因）均能检出，并且可检测其他试剂不检测的E基因，较为理想。其他几种试剂在对ORF1ab基因和N基因检测时均岀现了未检岀的情况，表明使用该试剂对病毒载量低的样本检测时存在假阴性的可能。分析原因可能由于疫情突发，各厂家在试剂的设计方面技术还有待完善，扩增时引物无法与靶位点特异性的结合，导致假阴性岀现呵。另一方面或许与试剂对不同位点的检测灵敏度相关，试剂对不同位点的敏感性存在差异，进而导致某些位点的漏检[10-11]。低浓度的样品往往对试剂盒的灵敏度有较高要求，如果试剂盒检测下限较高，则会导致假阴性结果，因此，在使用新的
试剂盒或更换批号时，需要进行全面的性能验证，以满足实验室的检测要求[12-13]o本实验中，由于阳性样本数量有限，无法进一步对试剂盒的特异性、检测下限及抗干扰能力等特性进行检测分析，后续需要进一步完善。
根据郭元元、沈利华等对国产SARS-CoV-2核酸检测试剂的研究发现，不同厂家的试剂盒检测能力差异较大[14-15]o现有试剂盒主要包括ORF1ab单靶标检测试剂盒,ORF1ab、N基因的双靶标检测试剂盒，同时包含ORF1ab、N基因与E基因的三靶标检测试剂盒，在使用RT-qPCR检测新型冠状病毒时，检测试剂应选择至少含2个位点的产品。在实验室确认阳性病例时，须满足以下条件：同一份标本中的2个靶标（ORF1ab、N基因）特异性RT-qPCR检测结果均为阳性。如果岀现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。
在研究过程中，本实验室仅使用各厂家某一批号的试剂盒进行检测，检测前按照规定对试剂盒进行了验证，以保证结果的准确性。但由于阳性标本仅有5例，可能难以代表该试剂盒的整体检测性能。下一步我们将扩大标本量，从多个角度，多个方面综合分析影响新型冠状病毒核酸检测结果的因素，为实验室检测提供更为真实、准确、可靠的参考依据。
综上所述，在突发的公共卫生事件下，很多试剂盒设计欠佳，后续还需要优化。无论是为了病毒核酸检测的准确性，用于病原学诊断需求，还是对复工复产复学人的核酸筛检的疫情精准防控，各检测实验室在有条件的前提下，建议同时使用两种厂家试剂进行检测。
[参考文献]
[1]国家卫生健康委员会办公厅.新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试
行第七版）[EB/OL]. （2020-03-04）[2020-08-11].www.
[2]GUAN W J,NI Z Y,HU Y,et al.Clinical characteristics of coron
avirus disease2019in China[published online ahead of print,2020 Feb28].N Engl J Med[Z].2020.
[3]CUI J,LI F,SHI Z L.Origin and evolution of pathogenic coron
aviruses[J].Nature Reviews Microbiology, 2019,17(3)：181-192.
[4]国家卫生部办公厅•医疗机构临床基因扩增检验实验室管理
办法[EB/OL].(2010-12-06)[2020-08-11]h ttp://v/
xxgk/pages/viewdocument.jsp dispatchDate=&staticUrl.
[5]国家卫生健康委办公厅.新型冠状病毒实验室生物安全指南
[EB/OL].(2020-01-23)[2020-08-11].v/qjjys/ s7948/202001/0909555408d842a58828611dde2e6a26.shtmL. [6]国家卫生健康委员会办公厅•新型冠状病毒感染的肺炎实验
室检测技术指南[EB/OL].(2020-02-07)[2020-08-11].http：//www.
nhcgov/jkj/s3577/202002/573340613ab243b3a7f61df260551dd4 shtmL.
[7]YANG Y, YANG M H.Evaluating the accuracy of different respira
tory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of SARS-Cov-2infections[Z].2020.
[8]张瑞，李金明，张媛•如何减少新型冠状病毒核酸检测的假阴
性[].中华医学杂志,2020,100(11):801—804.
[9]王成彬.核酸检测用于确诊新型冠状病毒肺炎阳性率低的原
因分析[].中华医学杂志,2020,100(13):961-964.[10]ZHOU P,YANG X L,WANG X G,et al.Discovery of a novel
coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in hu
mans and its potential bat origin[J].The Preprint Server for Blol-
ogy, 2020:914952.
[11]CAI G C X, ZHU X,ZHOU J.A hint on the COVID-19risk:pop
ulation disparities in gene expression of three receptors of
SARS-CoV[J].Prenprints,2020, 2:0408.
[12]中华医学会检验医学分会.2019新型冠状病毒核酸检测专家
共识[].中华医学杂志,2020,100(13):968-973.
[13]莫茜，秦炜，傅启华，等.正确认识新型冠状病毒核酸检测的
影响因素[J/OL].中华检验医学杂志,2020,43(3):213-216.
[14]郭元元，王昆，张宇，等.6种国产新型冠状病毒核酸检测试剂
检测性能比较与分析[].重庆医学,2020,3:1-10.
[15]沈利华，黄菲，陈祥，等.三种国产严重急性呼吸综合征冠状
病毒2(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒临床诊断效能评估[J/OL].
浙江大学学报(医学版),2020,3:1-10[2020-04-06].http:
//knski/kcms/detail/20200318.1412.004.htmL.
[收稿日期]2020-07-14[责任编辑]李洁
Doi:10.13621/j.1001-5949.2020.10.0916-病例报告-
坐骨结节撕脱骨折1例
马锋打罗小海2
［关键词］坐骨结节撕脫；骨折［中国分类号］R68.42
1病例资料
患者，男，15岁。患者跑步时突感右臀部撕裂样疼痛伴活动受限，就诊于我院，诊断为AFIT。查体：右臀轻度肿胀，皮肤无淤紫，右坐骨结节处深压痛，主动、被动屈曲髋关节时疼痛加重。辅助检查为X线和CT。麻醉满意后，患者俯卧位，常规消毒铺单,C臂机透视定位右坐骨结节；取右臀纹纵切口，长约8cm，显露出坐骨结节，见AFIT，移位约3.5cm。在坐骨结节对应闭孔处置入一锚钉，骨折复位满意后，用2枚可吸收螺钉固定，锚钉缝线加强固定。透视见骨折复位好，被动活动关节良好，冲洗、止血、依层缝合。术中出血量约60mL。2讨论
AFIT为坐骨结节附着肌肉过度收缩，或附着肌肉应力正常，骨质量下降所致，其中附着肌肉对坐骨结节的撕裂应力是导致AFIT的主要原因。AFIT易误诊为大腿后侧肌肉损伤，早期诊治可避免腘绳肌萎缩，利于患者的预后。MRI检查价值最高。目前AFIT无统一的分类标准和手术适应证，其治
核酸检测结果阳性参考值阴性［作者单位］1.宁夏回族自治区人民医院创伤骨科庁夏银川750002
2.宁夏医科大学，宁夏银川750004
［文献标识码］B
疗存在争议。一些学者认为AFIT方式的选择应基于骨折分离程度(DFD),DFD小的行保守，DFD
较大的行手术，也有学者认为应以患者对功能恢复的期望为依据。有报道对1例DFD<2cm的AFIT患者给予保守，效果良好，主张DFD<2cm者应保守⑴。多位学者提出DFD 2~3cm、骨不连、有神经系统症状是手术指征。该患者DFD 近端13.5mm，远端32.0mm，且累计骨骺。查阅相关文献，考虑不同方式的预后及并发症，同患者及家属沟通后决定采取手术。患者术后恢复好，出院1周可在保护下行走，定期复查结果良好。在临床工作中，应加强对AFIT的认识，便于进行早期诊断，选择合适的方法。目前AFIT的分类、手术指征没有统一的标准，还需要进一步研究。
［参考文献］
［1］MARCO C，SARA D R.A new evaluation system for early and successful conservative treatment for acute ischial tuberosity avulsion ［J］.Chin J Traumatol,2013,16(4):254-25.
［收稿日期］2019-10-12［责任编辑］王凯荣
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